در این مقاله به نحوه تهیه محیط کشت جامد برای کشت میکروارگانیسم ها میپردازیم.
پلیت های آگاردار، شامل محیط کشت های جامد برای رشد میکروارگانیسم ها هستند. محیط رشد میکروبی حاوی مواد مغذی و منبع انرژی برای مصرف میکروب ها در هنگام رشد است و آگار محیط را در حالت نیمه جامد و ژل مانند نگه می دارد.
همچنین میتوانید از مقاله نکات آزمایشگاه میکروبیولوژی درباره تمامی وسایل مورد استفاده در این آزمایشگاه نیز مطالعه کنید.
در محیط کشت جامد، یک میکروب منفرد رشد کرده و تقسیم می شود تا یک “کلنی”، متشکل از باکتری های یکسان تولید کند. انواع مختلف میکروب ها کلونی هایی با خصوصیات مختلف تولید می کنند، شکل، رنگ و بافت متفاوت دارند که به میکروب شناسان کمک می کند خالص بودن یک کشت را تشخیص دهند یا انواع میکروب ها را در یک نمونه مخلوط شناسایی کنند.
تعدادی از شرکت های بیولوژیک پلیت محیط کشت جامد از پیش ساخته شده را به فروش می رسانند اما محیطی که خودتان تهیه کنید بسیار ارزانتر است. با کمی تمرین خواهید فهمید که تهیه پلیت های شخصی بسیار آسان است و انعطاف پذیری بیشتری نیز خواهید داشت که می توانید دستورالعمل ها را متناسب با نیازهای خود شخصی سازی کنید.
نکته: میکروبیولوژیست ها معمولاً از پلیت های استریل و یکبار مصرف پلی استایرن استفاده می کنند، اما می توانید از ظروف شیشه ای پتری یا حتی شیشه های غذای کودک نیز استفاده کنید. اگر از ظروف شیشه ای یا شیشه استفاده می کنید، استریل کردن محیط کشت مستقیم در آنها آسان تر است. محیط را طبق مرحله 3 آماده کنید، اما به جای استریل کردن، آن را بجوشانید تا زمانی که آگار حل شود، سپس در ظرف های جداگانه بریزید. محیط موجود در ظروف را در اتوکلاو استریل کنید.
۱. انتخاب دستورالعمل تهیه محیط کشت جامد
از صفحه دستورالعمل های محیط کشت جامد و مایع در سایت آموزش ژنتیک یک دستورالعمل انتخاب کنید یا از یکی از دستورات خود استفاده کنید. روی قوطی حاوی پودر محیط کشت آماده هم طریقه تهیه آن نوشته شده است.
تصمیم بگیرید که به چند پلیت برای تهیه محیط کشت جامد نیاز دارید. دستورالعمل ها معمولا یک لیتر (1000 میلی لیتر) محیط کشت است، که برای پر کردن تقریباً چهل پلیت 100 میلی متری کافی است، اما در صورت لزوم می توان آنها را کم یا زیاد کرد. حدود 25 میلی لیتر محیط کشت آگار در هر پلیت 100 میلی متری ریخته می شود.
۲. آماده کردن مواد مورد استفاده در تهیه محیط کشت جامد
مواد تشکیل دهنده دستور العمل محیط کشت جامد
- ظروف استریل پلی استایرن، پتری. 100*15 میلی متر متداول ترین اندازه است، اما اندازه های 60 و 80 میلی متر نیز استفاده میشود.
- ظرف شیشه ای که حداقل دو برابر حجم محیط کشت شما را در خود نگه می دارد.
- فویل آلومینیومی برای پوشاندن محفظه محیط کشت و یا بسته بندی پلاستیکی اگر از مایکروویو استفاده می کنید.
- اتوکلاو، زودپز، مایکروویو یا صفحه داغ برای استریل کردن محیط کشت.
- دستکش مقاوم در برابر حرارت نگه داری ظرف های گرم.
- الکل ۷۰ درصد، تمیز کننده خانگی ، 10٪ وایتکس، یا دستمال مرطوب ضد عفونی کننده برای تمیز کردن محل کار.
- استوانه مدرج برای اندازه گیری آب.
- ترازو برای توزین مواد جامد.
- ابزارهایی برای برداشتن مواد جامد (مانند قاشق ها و ماسوره یا بشقاب و قاشق های کاغذی).
تصویر برخی مواد مورد نیازی برای تهیه محیط کشت جامد
۳. آماده سازی محیط کشت جامد
از یک ظرف شیشه ای (در حالت ایده آل یک ارلن مایر) استفاده کنید که حداقل دو برابر حجم محیط کشت شما را در خود نگه دارد.
- مواد را طبق دستورالعمل انتخابی خود جمع کنید.
- اگر از مایکروویو استفاده می کنید، آن را با فویل آلومینیوم یا پلاستیک بپوشانید.
نکته: روی جعبه های پودر آماده معمولا میزانی که باید در یک لیتر حل شود، نوشته شده است. شما میتوانید بسته به میزانی که نیاز دارید تهیه کنید تناسب بسته و مقداری از پودر که لازم دارید را وزن کنید، در ارلن ریخته و سپس در آب مقطر حل کنید.
تصویری از استفاده پلیت داغ و ماکروفر برای حل کردن آگار.
۴. استریل کردن محیط کشت آگار دار
یکی از مزایای محیط های پر نمک این است که میکروب های معمولی آلوده بر روی آن رشد نخواهند کرد، بنابراین محیط هایی با غلظت نمک حداقل 10٪ می توانند با جوشاندن استریل شوند.
اطمینان حاصل کنید که آگار کاملاً حل شده است. در محیط های حاوی 15٪ یا بیشتر نمک، آگار ممکن است به سرعت حل شود اما معمولا محیط کشت ابری به نظر می رسد، یا ممکن است اجسام کوچک و شفاف در آن شناور دیده شود. جوشاندن را ادامه دهید تا محیط کشت کاملاً شفاف شود. این مرحله معمولا بیش از 15 دقیقه طول می کشد. آگار ناقص حل شده محیط کشت شما را شکننده و کدر می کند.
سمت راست محیط کشتی که آگار کاملا در آن حل شده و سمت چپ محیط کشتی که آگار در آن حل نشده است.
۵. ریختن محیط کشت آگار دار به درون پلیت
- یک محل کار مناسب آماده کنید.
- بر روی پلیت ها نام محیط کشت، تاریخ و نام خودتان را بنویسید.
- محیط کشت های داغ را به شدت بچرخانید تا مخلوط شوند.
- محیط را تا حدی که برای نگه داشتن آن خنک شود، حدود 20-30 دقیقه درون بن ماری 50 درجه انکوبه کنید. اگر محیط کشت آگار خیلی خنک باشد، شروع به جامد شدن در ظرف می کند. اگر بیش از حد گرم باشد ، باعث میعان بیش از حد به درب ها می شود.
- دوباره محیط کشت را بچرخانید تا درست قبل از ریختن مخلوط شود. مراقب باشید حباب وارد نکنید.
- محیط را درون پلیت بریزید تا تقریباً 25 میلی لیتر را بپوشاند (به فیلم بالا مراجعه کنید).
- بعد از چند ساعت، پلیت ها را درون یک کیسه پلاستیکی قرار دهید. کیسه را با نوع محیط کشت و تاریخ برچسب بزنید و وارونه در یخچال نگه دارید.
نکته: اگر زمان زیادی ندارید، می توانید محیط جامد درون بطری ها را تهیه کنید، آن را استریل کنید و بگذارید کاملا در بطری سرد شود. بعداً می توانید محیط را در وان آب گرم یا مایکروویو گرم کنید تا ذوب شود. بگذارید تا خنک شود تا لمس آن راحت شود، سپس آن را درون پلیت ها بریزید.
امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و اگر به مطالعه درباره استارترهای تخمیری علاقه دارید، مقاله لینک شده را مطالعه فرمایید.
