انواع تست PCR و نحوه آنالیز آنها

از دیدگاه های متفاوت می توان دسته بندی های متفاوتی برای PCR انجام داد. بر اساس نوع تکنولوژی مورد استفاده می توان PCR را به سه دسته تقسیم کرد. شرکت دانش بنیان پویاژن آزما تولید کننده کیت های استخراج DNA و دارای آزمایشگاه تحقیقاتی مجهز، در این مقاله به انواع تست PCR ، ساز و کار PCR ، دسته بندی PCR بر اساس نوع تکنولوژی و نوع آنالیز آنها می پردازد.

ساز و کار PCR

همانطور که در مقاله اصول و پروتکل PCR (لینک اصول و پروتکل) توضیح دادیم دستگاه ترموسایکلر چند سیکل دماهایی را تکرار میکند تا شما تعداد زیادی از ژن هدف داشته باشید. شاید تصور کنید در هر سیکل میزان ژن دوبرابر شده و نمودار آن بصورت لگاریتمی بالا می رود. اما اینگونه نیست؛ بعد از سیکل 30 تا 35 این نمودار افقی شده و تعداد ژن هدف افزایش پیدا نمی کند که به آن فاز ثابت یا plateau میگویند. دلیل آن پایان یافتن مواد واکنش مثل نوکلئوتیدهاست. به همین دلیل ما حدود 30 تا 35 سیکل واکنش را ادامه می دهیم تا بیشترین میزان از ژن را به دست بیاوریم.

در ادامه مقاله انواع تست PCR و نحوه آنالیز آن با معرفی انواع PCR خدمت شما هستیم .

انواع PCR

تمامی تکنیک های PCR اساس و سازوکار یکسانی دارند. از نظر تکنولوژی مورد استفاده می توان PCR را به سه دسته تقسیم کرد:

End point PCR
Quantitative PCR
Digital PCR

End point PCR :

همان PCR معمولی و رایج است که برای اکثر کارهای مولکولی مثل مهندسی ژنتیک و کلونینگ استفاده می شود. که توضیحات کامل تر را از اینجا مطالعه کنید. همچنین درباره تاریخچه ایجاد تکنیک PCR می توانید از اینجا مطالعه کنید.

آنالیز آن با الکتروفورز ژل آگارز انجام می شود. در تصویر ژل الکتروفورز اندازه و کیفیت باندها را مشاهده می کنید. محصول این واکنش برای کلونینگ، تعیین توالی، ژنوتایپینگ و ردیابی توالی خاص استفاده می شود. در این روش نمی توانید به صورت کمی میزان ژن را مشخص کنید و فقط بر اساس پر رنگ و کمرنگ بودن باندها میتوانید تفاوت غلظت را مشاهده کنید.

تصویری از یک ژل آگارز با باندهایی با اندازه های متفاوت (مارکر) و تمیز

Quantitative PCR :

در qPCR شما بصورت کمی میزان وجود یک ژن یا RNA آن را مشخص می کنید. مقدار محصول با استفاده از یک نشانگر (prob) و یا رنگ فلورسنت (برای مثال سایبرگرین) را مشخص کرده بصورت کمی مشخص می شود. به این صورت که سیگنال فلورسنت با افزایش سنتز در دستگاه افزایش یافته و به این صورت می توانیم تغییرات بیان و میزان بیان را مشخص کنیم.

با رسم نمودار استاندارد کارایی این روش را مشخص کرده و میزان بیان هر ژن را اندازه گیری کرد.

نمودار A نمونه از نمودار استاندارد رسم شده برای qPCR و نمودار B نمودار amplification که دستگاه qPCR رسم میکند که سیکل و دریافت فلورسنت توسط دستگاه را نشان میدهد.

این نوع PCR برای بررسی میزان RNA (بیان ژن)، تفاوت تعداد کپی، تشخیص مولکولی و ژنوتایپینگ استفاده می شود.

برای مراجعه به صفحه تصفیه فاضلاب صنعتی میتوانید از این لینک استفاده کنید

Digital PCR :

این نوع PCR ابزار دقیقی برای بررسی تنوع ژنی است. بر اساس رفرنس و منابعی که به آن داده شده تعداد دقیق محصول را مشخص می کند.

در ادامه مقاله انواع تست PCR و نحوه آنالیز آن به انواع PCR از نظر کاربرد آن می پردازیم .

انواع PCR بر اساس کاربرد :

Real-Time PCR (PCR کمی یا qPCR)

در این روش مولکول های DNA با استفاده از رنگ فلورسنت، برای نظارت و تعیین کمی محصولات ریل تایم PCR نشان گذاری می شوند.

Reverse-Transcriptase (RT – PCR)

DNA مکمل (cDNA) توسط آنزیم reverse transcriptase با رونویسی معکوس RNA به DNA تهیه می شود.

reverse transcriptase Multiplex PCR

از چندین پرایمر برای ایجاد چندین قطعه ژن در یک نمونه PCR استفاده می کند.

Nested PCR

پس از چرخه 25 الی 35 PCR ، یک PCR اضافی با استفاده از پرایمرهای جدید بصورت “تو در تو” (nested) انجام می شود تا احتمال محصولات ناخواسته غیراختصاصی را کاهش دهد.

Hot Start PCR

در آن از گرما برای ازبین بردن ساختار آنتی بادی هایی استفاده می شود که برای غیرفعال سازی Taq polymerase PCR استفاده شده. توضیحات کامل تر در مورد این روش را در لینک مربوط به هات استارت می توانید بخوانید.

Long-range PCR

DNA هایی با اندازه بزرگ را با استفاده از مخلوطی از چند پلیمراز تکثیر کرد.

Assembly PCR

قطعات DNA طولانی با استفاده از پرایمرهای مختلف که باهم همپوشانی دارند تکثیر می شوند.

Asymmetric PCR

فقط یک رشته DNA هدف در PCR سنتز می شود.

In situ PCR

PCR که در سلول ها یا در بافت ثابت شده روی لام اتفاق می افتد.

سوالات متداول در مورد تکنیک PCR

از کجا بفهمم کدام آنزیم DNA Polymerase برای کار من مناسب است؟

آنزیم DNA Polymerase دارای 4 ویژگی خاص و مهم است که شما باید با توجه به هدف تحقیق، نوع مناسب خود را از این میان انتخاب نمایید. این 4 ویژگی در لینک رو به رو به تفصیل توضیح داده شده اند: انتخاب DNA پلیمراز مناسب

تکنیک PCR را می دانم، اما در مورد تنظیمات دستگاه مطمئن نیستم؟

هر تکنیکی دارای یک پروتکل مشخص است، با مشاهده ی لینک زیر، می توانید کلیاتی از کارکرد دستگاه یاد گرفته و با توجه به ژن و پرایمرهای خود، دستگاه را برای استفاده تنظیم کنید.

اصول و پروتکل PCR

چگونه برای یک ژن خاص پرایمر طراحی کنم؟

پرایمرها باید به گونه ای طراحی شوند که مکمل رشته الگو DNA باشند. در لینک زیر آموزش طراحی پرایمر به صورت کامل و رایگان آورده شده است:

آموزش طراحی پرایمر

برای خرید کیت استخراج میتوانید از این لینک استفاده کنید

با تشکر از همراهان گرامی پویاژن آزما . امیدواریم مقاله انواع تست PCR و نحوه آنالیز آن مفید واقع شده باشد .

انواع تست PCR و نحوه آنالیز آنها