آموزش سنتز cDNA
برای بررسی بیان ژنهای خاص در یک نمونه و بررسی حضور ژن موردنظر مثلا تشخیص بیماری با بیومارکرهای اختصاصی پس از استخراج RNA از نمونه موردنظر باید تست ریل تایم RT-PCT انجام شود. اما RNA پایداری مناسبی برای این تست ندارد .پس لازم است ابتدا آن را به cDNA یا complementary DNA تبدیل کنیم. این کار با استفاده از آنزیم ریورس ترنسکریپتاز در دستگاه ترموسایکلر، طبق ویدئو انجام میشود.
https://www.aparat.com/v/QMUoj
برای انجام این تست ابتدا لازم است RNA نمونه موردنظرتون استخراج کنید. برای اینکار میتوانید آموزش استخراج RNA با ترایزول را از اینجا مشاهده کنید. بر اساس هدفی که از انجام تست دارید سه نوع پرایمر را میتوانید انتخاب کنید. این سه نوع شامل : اولیگو dT، رندوم هگزامر و پرایمر اختصاصی.
همانطور که میدانید انتهای mRNA در انتهای خود دارای دم پلی A میباشد . در نتیجه وقتی شما میخواهید فقط mRNA را بررسی کنید کافیست از پرایمر اولیگو dT استفاده کنید. اما توجه کنید که میزان cDNA در نهایت کم خواهد بود. برای افزایش این مقدار و هنگامی که mRNA مدنظر شما نیست و یا نمونه یوکاریوتی نیست میتوانید از رندوم هگزامر استفاده کنید که ۶ نوکلئوتید رندم هستند و هر بخشی از هر RNA میتوانند متصل شده و همچنین مانع از ایجاد ساختارهای ثانویه نیز میشوند.
برای خرید کیت استخراج کلیک کنید
رندم هگزامرها و پرایمر الیگو dT
اما میتوان ویژگی های مثبت این دو پرایمر را مخلوط کرده و از پرایمر اختصاصی استفاده کرد. در این حالت توالی RNA مورد نظر شما سنتز میشود ولی کارای و میزان cDNA بسیار کم خواهد بود.
پرایمر اختصاصی
معمولا در کیت هایی که استفاده میشوند در ابتدا پس از افزودن RNA و پرایمر به میکروتیوب باید حدود ۵ دقیقه در دمای ۷۰ درجه باقی بماند تا ساختارهای ثانویه RNAها باز شده و خطی شوند. پس از آن آنزیم، بافر آن و آب مقطر اضافه شده و داخل دستگاه قرار میگیرد و ابتدا در دمای اتصال پرایمرها متصل شده و پس از یک ساعت در دمای اپتیموم آنزیم، میزان مناسبی از cDNA خواهیم داشت.
مراحل سنتز cDNA با استفاده از پرایمر الیگو dT
برای خرید کیت استخراج کلیک کنید
برای مراجعه به صفحه تصفیه فاضلاب صنعتی میتوانید از این لینک استفاده کنید