در این مقاله از پویاژن میخواهیم به آموزش کلونینگ ژن- مرحله لایگیشن بپردازیم
اصول مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن را در مقالات قبل توضیح دادیم . این آخرین مرحله ایجاد پلاسمید نوترکیب است . به دلیل استفاده از آنزیم T4 DNA لیگاز به این مرحله لایگیشن می گوییم . این آنزیم با ایجاد پیوند فوسفودی استر باعث اتصال دو انتهای DNA با اتصال Oh آزاد یک رشته به فسفات رشته ی دیگر می شود . برای توضیحات کامل تر و روش انجام این مرحله با ما همراه باشید.
برای مشاوره و کارآموزی برای مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن میتوانید با ما تماس بگیرید
09101438051
02140443676-7
https://www.aparat.com/v/6js7I
مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن
-
استخراج پلاسمید و ژن که میتوانید از انواع کیت استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید
-
دایجستشن با آنزیم های محدود کننده و الکتروفورز
-
لایگیشن (ligation)
-
ترنسفورم به باکتری میزبان و کشت باکتریها (transform)
-
انتخاب کلونی (colony selection)
-
کشت باکتری برای تولید پروتئین موردنیاز
-
تخلیص پروتئین
نکته: دقت کنید که برای اطمینان از صحت انجام کلونینگ ژن مراحل مختلف باید هر مرحله استخراج، PCR، الکتروفورز و برای اطمینان کامل تعیین سکانس ژن موردنظر انجام شود.
مرحله لایگیشن
موفقیت در کلونینگ به درست انجام شدن لایگیشن وابسته است. برای یک لایگیشن مناسب شما باید از آنزیم محدودکننده مناسب استفاده کنید. بعد از هضم آنزیمی (دایجست) پلازمید حامل و ژن موردنظر با یک آنزیم محدودکننده، باید ژن موردنظر و پلازمید در یک جهت مناسب (برای رونویسی درست از ژن) با استفاده از انتهای چسبنده متصل شوند.

تصویری از عملکرد آنزیم لیگاز که از انتهای آزاد یک رشته استفاده کرده و با مصرف ATP آن را به فسفات رشته مقابل متصل میکند
اگر در ژن انتهای چسبنده مناسب مجود ندارد باید با استفاده از DNA پلیمراز و dNTP ها این انتهای چسبنده ایجاد شده و یا با استفاده از PEG آنها را به یکدیگر متصل کنید.
برای رفتن به صفحه فروشگاه و خرید کیت استخراج DNA دلخواه خود از این لینک استفاده کنید.
مواد موردنیاز برای انجام لایگیشن در کلونیگ ژن
-
DNA تخلیص شده و دایجست شده
-
پلازمید تخلیص شده و دایجست شده
-
T4 DNA لیگاز 0/5 تا 1 میکرولیتر
-
بافر آنزیم T4 DNA لیگاز
-
آب مقطر بدون نوکلئاز (حجم نهایی 10 میکرولیتر)
مقدار ژن و پلازمید به اندازه و غلظت آنها بستگی دارد. اما در یک کلونینگ معمولی که اندازه ژن کوچکتر از پلازمید است معمولا با نسبت 3 به یک (ژن 3 برابر پلاسمید) مناسب خواهد بود و 100 نانوگرم از DNA میتواند برای یک لایگیشن استاندارد کافی باشد. برای محاسبه مقادیر میتوانید از سایت محاسبه لایگیشن هم استفاده کنید.