پویاژن آزما

آموزش مهندسی ژنتیک – انتخاب کلونی حامل پلاسمید نوترکیب

آموزش مهندسی ژنتیک

اهداف و مراحل مهندسی ژنتیک ( قبل تر بصورت کلی توضیح داده شد. در این مقاله قصد داریم آخرین مرحله از کلونینگ ژن را بطور دقیق بررسی کنیم. در این مرحله میخواهیم کلونی هایی که حامل پلاسمید نوترکیب (پلاسمید حاوی ژن موردنظر) هستند را شناسایی کنیم.

برای کارآموزی کامل مهندسی ژنتیک و مشاوره در این زمینه میتوانید با ما تماس بگیرید. کارآموزی در شرکت پویاژن آزما به این صورت هست که شما پس از آموزش توسط کارشناسان ما خودتان بطور کامل مراحل را انجام داده تا از اینکه یاد گرفته اید اطمینان حاصل شود.

09101438051

02140443676

 

مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن

  • استخراج پلاسمید و ژن که میتوانید از انواع کیت استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید و الکتروفورز
  • دایجستشن با آنزیم های محدود کننده و الکتروفورز
  • لایگیشن (ligation)
  • ترنسفورم به باکتری میزبان و کشت باکتریها (transform)  (/)
  • انتخاب کلونی (colony selection)
  • کشت باکتری برای تولید پروتئین موردنیاز
  • تخلیص پروتئین

نکته: دقت کنید که برای اطمینان از صحت انجام کلونینگ ژن مراحل مختلف باید هر مرحله استخراج، PCR، الکتروفورز و برای اطمینان کامل تعیین سکانس ژن موردنظر انجام شود.

مرحله انتخاب کلونی

پس از آنکه شما پلاسمید ها را به درون باکتری های مستعد شده فرستادید حالا باید باکتری ها را کشت دهیم تا بتوانیم از آنها استفاده کنیم. اما ژن هایی که ما وارد باکتری ها کردیم چند نوع میتوانند باشند:

  • پلاسمید هایی بدون ژن خارجی (هنگام لایگیشن دو انتهای خود پلاسمید به هم متصل شده)
  • ژن ها به تنهایی
  • پلاسمیدهایی که حامل ژن خارجی هستند

برای تایید حضور پلاسمید درون باکتری از مارکر آنتی بیوتیک استفاده میکنیم. هر پلاسمید مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک ایجاد میکند. با افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت، باکتری های حامل پلاسمید در آن رشد میکنند. اما در اینجا ما به باکتری هایی نیاز داریم که پلاسمید حامل ژن خارجی (پلاسمید نوترکیب) را حمل میکنند. برای اینکار روش های متفاوتی وجود دارد که رایجترین آن کلونی آبی و سفید است. این روش بسیار قابل اطمینان است و با استفاده از عملکرد آنزیم بتا گالاکتوزیداز در اوپران لک (lac operon) که لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تجزیه میکند.

حضور لاکتوز در محیط کشت باعث فعال شدن ژن های آن میشود. بیشتر پلاسمیدهایی که برای مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن استفاده میشوند حامل قسمتی از این اپران یعنی ژن LacZ هستند . این ژن آنزیم بتاگالاکتوزیداز را تولید میکند. با تغییراتی در این ژن جایگاه برش بسیاری از آنزیم های محدود کننده وجود دارد (multiple cloning site (MCS)) تا شما بتوانید ژن خارجی را درون آن قرار دهید و این ژن را غیرفعال کنید و دیگر در حضور لاکتوز آنزیم فعالی تولید نمیشود. درحالیکه پلاسمیدهایی که نوترکیب نیستند آنزیم را بصورت فعال تولید کرده و لاکتوز را تجزیه میکنند.

کلونی آبی و سفید چگونه ایجاد میشود؟

برای شناسایی کلونی هایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند از یک سوبسرای رنگی به نام X-gal بجای لاکتوز استفاده میکنیم و آن را به پلیت آگار اضافه میکنیم. این ماده از هیدرولیز 5-bromo-4-chloro-indoxyl بدست آمده که وقتی تجزیه شود ماده ای آبی رنگ به نام 5,5’-dibromo-4,4’-dichloro-indigo رسوب میکند. این ماده ساختاری شبیه لاکتوز دارد و آنزیم بتاگالاکتوزیداز آن را تجزیه میکند. درنتیجه باکتری هایی که حامل پلاسمید هستند اما این پلاسمید نوترکیب نیست این ماده را تجزیه کرده و کلونی های آبی ایجاد میکنند درحالیکه باکتری های حامل پلاسمید نوترکیب هستند نمیتوانند آن را تجزیه کرده و کلونی های بی رنگ یا سفید ایجاد میشود.

همچنین درکنار X-gal از Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) نیز استفاده میشود که آنالوگ غیرمتابولیزه گالاکتوز است و باعث فعال شدن ژن بیان ژن lacZ میشود. دقت کنید که IPTG سوبسترای ژن بتاگالاکتوزیداز نیست و فقط محرک آن است.

آموزش مهندسی ژنتیک کلونی حامل پلاسمید

تصویری از یک پلاسمید وکتور حامل ژن مقاومت به آنتی بیوتیک و lacZ که جایگاه برش چندین آنزیم محدودکننده را دارد.

 

برای خرید کیت استخراج در انواع مختلف میتوانید به لینک فروشگاه پویاژن مراجعه بفرمایید.

 

مراحل انجام انتخاب کلونی در مهندسی ژنتیک چگونه است؟

برای این کار تنها کافیست پس از ترنسفورم کردن که در مقاله قبل توضیح دادیم، باکتری ها را روی محیط کشت آگار حاوی آنتی بیوتیک، X-gal و IPTG کشت دهید. کلونی های سفید همگی حامل ژن هستند. برای اطمینان صد درصدی از وجود ژن اختصاصی خود درون این باکتری ها، پس از رشد میتوانید با پرایمر های ژن اختصاصی خود، روی یکی از کلونی ها، کلونی PCR انجام دهید که در مقالات آینده توضیح خواهیم داد و سپس آن را تعیین سکانس کنید.

 

مهندسی ژنتیک

تصویری شماتیک از پروسه انتخاب کلونی

 

 

مرحله اخر 

حالا میتوانید کلونی ها را برای نگهداری ژن استوک بگیرید تا برای مدت طولانی حفظ کنید . برای تولید یک پروتئین نوترکیب آن را پس از کلون وارد میزبانی برای تولید پروتئین کرده و یا درون همان باکتری پروتئین های تولیدی را بررسی کرده و پس از اطمینان توسط SDS-PAGE و وسترن بلات برای تولید انبوه از آن میزبان استفاده کنید.

 

کلونی حامل پلاسمید

تصویری از یک پلیت آگار که کلونی های آبی و سفید روی آن رشد کرده. کلونی های سفید باکتری های حامل پلاسمید نوترکیب هستند.

 

 

 

برای مراجعه به صفحه تصفیه فاضلاب صنعتی به این لینک مراجعه کنید .

 

برای آموزش و انجام تمامی مراحل مهندسی ژنتیک توسط خودتان  با ما تماس بگیرید و در کارآموزی مهندسی ژنتیک ثبت نام کنید. با تضمین آنکه تمامی مراحل را خودتان انجام میدهید تا کاملا یاد بگیرید.

09101438051

02140443676

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من