این مبحث با نشان دادن انتشار همه جایی میکروارگانیزم ها لزوم رعایت شرایط استریل را در هنگام کار در آزمایشگاه نیز یادآوری می کند. میکروارگانیزم ها همه جا هستند ، در اعماق اقیانوسها ، در قلل پوشیده از برف ، در انواع چشمه های آب گرم حتی در چشمه های آب گرم دهانة آتشفشان، در شیر ، در آب ، روی سطح بدن و در داخل بدن و بطور کلی ما در احاطة میکروارگانیزمها هستیم.
در مقاله دیگری با نحوه تهیه انواع محیط کشت میکروبی آشنا شدیم. این مقاله همچنین با روشهای کشت دادن نمونه های مختلف آشنا می شوید. نمونه هایی که می توان از آنها میکروارگانیزم جدا کرد از سه حالت جامد ، مایع و گاز بیرون نیست. نمونه های جامد به دو حالت قابل حمل و غیر قابل حمل می باشند. جامدات قابل حمل می تواند حالت تکه های ریز نظیر خاک ، غذاهایی مانند برنج و حبوبات و غیره باشد یا تکه های درشت مانند گوشت ، میوه و نظایر آنها باشد. نمونه مایع به دو حالت شفاف و کدر می باشد.
پروتکل جداسازی میکروارگانیسم ها
1- جدا کردن میکروارگانیزم ها از جامدات ریز (خاک):
مقدار 5/0 گرم خاک را وزن کرده ودر 5 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل درون لولة آزمایش با هم زدن بصورت سوسپانسیون در آورید. سپس 15-10 دقیقه لوله آزمایش را ساکن گذاشته تا ذرات خاک رسوب کند در حالیکه باکتریهای سوسپانسیون شده در این حالت راسب نمی شوند. 100 میکرولیتر از مایع رویی را با استفاده از سمپلر بر روی یک پلیت N.A. ریخته و با استفاده از پارو بر روی محیط پخش کنید تا کلنی های مجزا از هم بر روی محیط رشد کند.
100 میکرولیتر از محلول رویی را به 20-15 میلی لیتر محیط N.A. مذاب با دمای 45-40 درجه اضافه کرده ، به آرامی هم زده و سپس درون پلیت بریزید. پلیتها را مدت 72-48 ساعت در دمای 30 درجه یا دمای محیط قرار دهید. در پلیت اول باکتریهای هوازی در سطح محیط رشد می کنند و در پلیت دوم باکتریهای هوازی در سطح و باکتریهای بی هوازی در عمق محیط رشد می کنند.
در خاک انواع میکروارگانیسم های بیماریزا و غیر بیماریزا وجود دارد
2- جدا کردن میکروارگانیزم از نمونه جامد بزرگ (گوشت):
ابتدا نمونه مورد نظر را با استفاده از اسکالپل استریل کاملا خرد کرده و سپس بقیه مراحل را شبیه خاک انجام دهید.
درون گوشت انواع میکروارگانیسم ها میتواند وجود داشته باشد که با خوب پختن از بین میرود
3- جدا کردن میکروارگانیزم ها از روی میز کار آزمایشگاه:
این آزمایش اهمیت تمیز کردن میز کارتان را با ماة ضد عفونی کننده نشان می دهد . سوآب پنبه ای استریل را با سرم فیزیولوژی استریل مرطوب کرده و روی میز کار در قسمتهای مختلف کشیده و آن را بر روی سطح پلیت حاوی N.A. به آرامی در جهات مختلف بکشید. این عمل را بعد از ضد عفونی کردن میز در یک پلیت دیگر تکرار کنید و پلیتها را که اسم و تاریخ در پشت آن نوشته شده در گرمخانه 30 درجه به مدت 48 ساعت قرار دهید و نتیجه را با کمتر بودن تعداد کلنی ها در پلیت دوم ببینید. با این آزمایش به خاطر داشته باشید که میز کارتان را همیشه قبل وبعد از پایان کار ضد عفونی کنید.
تصویری از آزمایشگاه پویاژن آزما
4- جدا کردن باکتری ها از پوست بدن:
در این آزمایش می توانید قسمتهای مختلف سطح بدن را برای وجود میکروارگانیزمها آزمایش کنید بعنوان مثال می توانید انگشت دست خود را به آرامی در یک پلیت حاوی N.A. در جهات مختلف کشیده و در پلیت دیگری همین عمل را بعد از شستشوی دست با صابون و بعداز شستشوی دست با اتانل 70% در حالیکه دست مرطوب است تکرار کنید و نتیجه را ببینید. همچنین می توانید سوآب پنبه ای مرطوب را به کف دست خود کشیده و آن را روی پلیت منقل نمائید. پلیتها را بصورت وارونه مدت 48 ساعت در گرمخانه 30 درجه بگذارید.
5- جدا کردن باکتریها از بدن :
در این آزمایش از محیط Trypticase Soy Agar (T.S.A.) یا Blood agar استفاده می کنیم زیرا این محیط برای رشد استرپتوکوکها و سایر میکروارگانیزمهایی که معمولاً در بدن وجود دارند و احتیاج غذایی پیچیده تری دارند مناسب می باشد.
برای این آزمایش به دو روش زیر عمل کنید:
- یک سوآب پنبه ای استریل را به حلق ، زبان ، لثه ها بین دندانها یا قسمتهای دیگر حفرة دهان کشیده و سپس در کنار شعله در تمام جهات بر روی محیط بکشید.
- خلط بیرون آمده از ریه ها یا سینوسها را در یک ظرف شیشه ای استریل جمع کرده و سپس با یک سوآب پنبه ای استریل خلط را همزده و سوآپ را بر روی سطح پلیت در تمام جهات بکشید.پلیتها را در حرارت 37 درجه که حرارت طبیعی بدن انسان است به مدت 48 ساعت قرار دهید.
6- جدا کردن میکروارگانیزمها از هوا
سلولهای میکروبی آنقدر کوچک و سبک هستند که دائماً توسط جزیان هوا در حرکتند و یا روی ذرات گرد و خاک می نشینند. برای نشان دادن این مطلب درب پلیت حاوی N.A. را که پشت آن اسم و تاریخ را نوشته اید باز می کنید و مدت 20 دقیقه درب آن را باز می گذارید . پلیتها را در خارج آزمایشگاه ، در هوای آزاد ، روی میز و در محلی که بیشتر در معرض رفت و آمد است و در نقاط مختلف آزمایشگاه می توانید قرار دهید. بعد از این مدت درب پلیتها را بسته و آنها را مدت 48 ساعت در گرمخانة 30 درجه قرار دهید. توجه دارید که بجز موارد خاص پلیتها را همیشه باید وارونه در گرمخانه قرار داد.
7- جدا کردن میکروارگانیزم از نمونه مایع کدر، مانند آب جوی:
ابتدا با استفاده از لوله آزمایش استریل حدود ml 5 آب را از محل مورد نظر جدا و به آزمایشگاه منتقل کنید. 100 میکرولیتر از نمونه را با استفاده از سمپلر بر روی محیط N.A. بصورت قطره قطره قرار داده و سپس با پارو پخش کنید. جهت بررسی باکتریهای بی هوازی شبیه نمونه خاک عمل کنید.
8- جدا کردن میکروارگانیزم از نمونه مایع شفاف مانند آب آشامیدنی ، آب چشمه و …:
اینگونه آبها دارای تعداد باکتری خیلی کمی می باشند. حدود ml 50 از نمونه مورد نظر در لوله آزمایش یا ظرف مناسب استریل به آزمایشگاه منتقل می گردد سپس ml 10 از آن مدت 10 دقیقه در rpm 5000 سانتریفوژ شده و محلول رویی خالی می گردد. رسوب حاصل در مقدار کم آب بجا مانده در ته لوله سوسپانسیون شده و سپس 100 میکرولیتر از آن مانند روش گذشته بصورت هوازی و بی هوازی کشت داده می شود.
تمام پلیتهای کشت داده شده بعد از نوشتن نام ، تاریخ و نام نمونه به مدت 48-24 ساعت در انکوباتور 35 تا 37 قرار داده شود.
امیواریم این مقاله برای شما مفیده بوده و همچنین میتوانید برای مرحله بعد یعنی شناسایی باکتری های از روی کلنی آنها میتوانید مقاله شناسایی کلنی را مطالعه کنید.
