پویاژن آزما

رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی منفی

microphotograph-of-example-of-staining-bacteria-using-gram-method--at-x1250-magnification-173288072-ab648ac296f846faaa075a7101f06024

برای کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی میکروارگانیسم ها را بصورت زده و مرده (رنگ آمیزی شده) با استفاده از میکروسکوپ مشاهده کنیم. در مقالات قبل درباره مشاهده باکتری ها بصورت زنده توضیح داده شد. همچنین میتوانید درباره انواع محیط کشت و نحوه جداسازی میکروارگانیسم ها از محیط های مختلف مطالعه کنید. در این مقاله آزمایشگاه همکار پویاژن آزما تولید کننده انواع کیت استخراج DNA و محصولات بیوتکنولوژی، تلاش کرده تا روش مشاهده میکروارگانیسم ها با رنگ آمیزی منفی و گرم آموزش دهد.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید. 

09101438051
021404436-7

کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

رنگ آميزي منفي و رنگ آميزي گرم

رنگ آميزي منفي (negative staining)

اصول

در اين نوع رنگ آميزي بايد از رنگ هاي اسيدي مثل مركب چين ( indian ink) يا نيگروزين استفاده كرد اين رنگ ها داراي كروموژن با بار منفي هستند وبه اين ترتيب قادر به نفوذ درون سلول نيستند چرا كه بار الكتريكي سطح سلول هاي باكتري ها نيز منفي است. بنابر اين، سلول هاي فاقد رنگ در زمينه اي رنگي قابل رويت خواهند بود از اين رنگ آميزي براي بررسي باكتري هايي كه به سختي رنگ مي گيرند و اسپورها استفاده مي شود. در اين روش نيازي به فيكساسيون حرارتي نيست و سلول ها در معرض اثرات ناشي از مواد شيميايي و حرارت ( همانند تغيير شكل سلول ) قرار نمي گيرند بنابراين اندازه و شكل سلول ها به صورت طبيعي مشاهده مي شود.

مواد مورد استفاده رنگ آمیزی منفی

محيط كشت

كشت مخلوط باكتري هاي مورد نظر درلوله.

معرف

نيگروزين يا مركب چين

لوازم مورد نياز

شعله چراغ ـ لوپ تلقيح ـ سيني رنگ آميزي ـلام شيشه اي وميكروسكپ.

پروتکل رنگ آمیزی منفی

1) يك قطره نيگروزين رادريك انتهاي لام قراردهيد.

2) يك لوپ پراز باكتريهاي مورد نظر را در اين قطره وارد كرده وبا فيلدوپلاتين،رنگ وباكتري را كاملاً مخلوط كنيد(شکل a,b).

3) به كمك يك لام ديگر ، اين مخلوط رنگ – باكتري ،را در سطح لام بگسترانيد در اين حالت لام دوم را با يك زاويه 30 تا 45 درجه اي، از محل قطره تا محل نزديك به انتهاي ديگر لام بكشانيد(شكل c,d ) .

4) بگذاريد گسترش در هوا خشك شود(شکلe) .(لام را توسط حرارت خشك نكنيد).

5) با ميكروسكپ زمينه روشن وبا عدسي 100 نمونه را بررسي كنيد.

رنگ آمیزی منفی

روش تهیه گسترش نازک و رنگ آمیزی منفی

رنگ آمیزی منفی

رنگ آمیزی منفی باسیلوس

رنگ آميزي گرم

اهداف

1) اساس شيميايي وتئوري با روشهاي رنگ آميزي تفرقي (diffrentiate staining)

2) اساس شيميايي رنگ گرم

3) تمايز بين دو گروه از با كتري ها(گرم مثبت وگرم منفي)

اصول كلي رنگ آمیزی گرم

رنگ آميزي گرم مهمترين روش رنگ آميزي در ميكروبيولوژي است و به منظور شناسايي و تشخيص افتراقي باكتري هاي مختلف استفاده مي شود. كريستين گرم، دانشمند دانماركي اين روش را ابداع كرد (1884). لازمه اين نوع رنگ آميزي افتراقي، استفاده از چهار نوع عامل يا معرف شيميايي است كه به ترتيب بعد از فيكساسيون توسط حرارت بكار برده مي شوند. عمل اولين رنگ، رنگ آميزي تمام سلول هاي باكتريايي مي باشد. براي تثبيت بهتر رنگ دومين عامل كه لوگل نام دارد و تر كيبي از يد و يدور پتاسيم است اضافه مي شود.

سومين عامل يك معرف رنگبر است كه از جنس الكل يا مخلوط الكل ـ استون مي با شد. بر پايه تركيب شيميايي ديواره سلولي با كتري ها، عوامل رنگبر قادرند رنگ اوليه را بطوركامل از سلول زدوده و يا اينكه فقط از ساختمان خاص سلولي آن را تخليه نمايند اگر رنگ اوليه از سلول تخليه شود سلول بي رنگ شده، اجازه ورود به رنگ دوم را مي دهد. آخرين معرف، رنگ زمينه است كه رنگي متضاد با رنگ اوليه دارد به اين تر تيب انواع سلول ها يا تر كيبات آن ها مي توانند در اين نوع رنگ آميزي بر پايه رنگي كه درون سلول باقي مي ما ند از يكديگر متمايز گردند.

رنگ اوليه در رنگ آمیزی گرم

در رنگ آميزي گرم، رنگ اوليه كريستال ويوله است كه به رنگ بنفش مي باشد. بنابراين در اولين مرحله تمام سلول ها (چه گرم مثبت وچه گرم منفي) اين رنگ بنفش را به خود مي گيرند، اين رنگ جزء رنگهاي بازي است و جذب سلول ها مي شود.

سير(تند ) كننده رنگ (mordant)

از محلول لوگل براي سير كردن رنگ اوليه استفاده مي شود ومحلولي است كه با رنگ اوليه تركيب شده، كمپلكس كريستال ويوله ـ يد(CV-I) تشكيل مي دهند. تشكيل اين كمپلكس سبب تشديد رنگ ا وليه شده ودر نتيجه تمام سلول ها به رنگ بنفش تيره در مي آيند. فقط در باكتريهاي گرم مثبت ، (CV-I)به كمپلكس منيزيم ـ ريبونوكلوئيك اسيد (mg-RNA) متصل شده و كمپلكس منيزيم ـ ريبونوكلوئيك اسيدـ كريستال ويوله ـ يد(CV-I-RNA-mg)تشكيل مي شود كه به مراتب مشكل تر از كمپلكس (CV-I) زدوده مي شود.

معرف رنگبر در رنگ آمیزی گرم

اتانول 95% دو كار انجام مي دهد

1)حلال چربي است. 2) عامل دهيدراته كنندگي پروتئين ها ميباشد.

عملكرد عامل رنگبر به ضخامت لايه ليپيدي ديواره سلولي باكتري ها بستگي دارد .در باكتري هاي گرم مثبت ضخامت اين لايه بسيار كم بوده و اين عامل مهمي براي بقاي كمپلكس (CV-I-RNA-mg) است. بنابراين، مقدار كم تركيبات ليپيدي به سرعت توسط الكل حل شده باعث تشكيل منافذ ريزي در ديواره سلول مي شود. بدنبال آن اثر آبگيري(هيدراتاسيون) الكل سبب مسدود شدن اين منافذ مي شود . در نتيجه پيوند محكم اوليه برداشته نشده ، وسلول به رنگ بنفش باقي مي ماند.

در سلول هاي گرم منفي، لايه ليپيدي موجود در غشاء خارجي ديواره سلولي، تراكم زيادي دارد، بنابراين توسط الكل حل شده و منافذ متعددي را در ديواره سلول تشكيل مي دهد كه بطور محسوس با عمل دهيدراته شدن پروتئين هاي ديواره سلولي توسط الكل بسته نمي شود. اين عمل باعث تسريع در تخليه كمپلكس شده و در نتيجه اين سلولها بي رنگ مي شوند.

رنگ مخالف يا رنگ زمينه در رنگ آمیزی گرم

سافرانين ـ اين عامل باعث رنگ كردن سلول هايي مي شود كه قبلاً توسط الكل رنگبري شده اند. از آنجا كه سلول هاي گرم منفي داراي اين خاصيت هستند ، در اين مرحله سافرانين را جذب مي كنند وقرمز مي شوند . به جاي سافرانين مي توان از كربول فو شين استفاده كرد.

نكاتي مهم در زمينه تهيه و آماده سازی رنگ آمیزی گرم

1) مر حله بحراني اين رنگ آميزي ، مرحله رنگبري است. اگر اين مرحله طولاني شود ميكروبهاي گرم مثبت رنگ خود را از دست داده وظاهرگرم منفي به خود مي گيرند واگر اين زمان خيلي كوتاه باشد كمپلكس ((CV-I بطور كامل خارج نشده ، باكتري گرم منفي بصورت گرم مثبت به نظر مي ايد.

2) شستشوي لام با آب درمراحل مختلف رنگ آميزي ضروري است . اين عمل باعث زدودن رنگها و معرفهاي مازاد از روي گسترش شده ولام را براي انجام مراحل بعدي آماده ميكند.

3) كشت باكتري بايد جوان(24 ساعته) باشد . كهنه بودن كشت، خصوصاً درباكتري هاي گرم مثبت، سبب مي شود كه ميكروارگانيسم ها توان نگهداري رنگ اوليه را از دست داده ، بصورت گرم متغير(gram variable) ديده شوند. در اين حالت تعدادي از سلول ها به رنگ بنفش وتعدادي ديگري به رنگ قرمز و اكثر باكتريها به رنگي بين بنفش و قرمز ديده مي شوند.

مواد و روش ها برای رنگ آمیزی گرم

كشت ها

از كشت هاي 24 ساعته باكتري هاي مورد نظر استفاده مي شود.

معرف ها

كريستال ويوله ـ لوگل ـ اتانل 95% وسافرانين.

لوازم مورد نياز برای رنگ آمیزی گرم

شعله چراغ ـ لوپ ـ سيني رنگ آميزي ـ لامهاي شيشه اي ـ كا غذ خشك كن ـ ميكروسكپ.

پروتکل رنگ آمیزی گرم

1) تهيه گسترش از باكتري خالص و مخلوطي از باكتريهاي مورد نظر

2) خشكاندن در مجاورت هوا

3) فيكساسيون با حرارت

4) افزودن چند قطره كريستال ويوله (به مدت 30 ثانیه تا یک دقیقه دقيقه) روي گسترش (a).

5) شستشوي گسترش درزيرجريان آرام آب(b).

6) افزودن چند قطره لوگل روي گسترش(به مدت 1 دقيقه)(c) .

7) شستشوي گسترش درزيرجريان آرام آب (d).

8) افزودن چند قطره محلول الكل 95% روي گسترش تا زماني كه آخرين قطرات بنفش رنگ ازگسترش خارج شود (توجه : زمان رنگبري نبايد طولاني شود. حدود 20-10 ثانيه )(e)

9) شستشوي گسترش درزيرجريان آرام آب(f) .

10) افزودن چند قطره سافرانين روي گسترش به مدت 30-20 ثانيه(g).

11) شستشوي گسترش در زيرجريان آرام آب(h).

12) خشك كردن گسترش با استفاده از كاغذ خشك كن.

13) مشاهده ميكروسكوپي (با بزرگنمایی های مختلف ولی در نهایت باید با عدسي×100 بررسی گردد).

توجه در اين رنگ آميزي، باكتريهاي گرم مثبت به رنگ بنفش ، وبا كتريهاي گرم منفي به رنگ قرمز ديده مي شوند.

روش رنگ آمیزی گرمروش رنگ آمیزی گرم

مشاهدات ونتايج رنگ آمیزی گرم

1)تصوير يك ميدان ديد ميكروسكپ را نقاشي كنيد.

2) سلول ها را براساس شكل و ترتيب قرارگيري توضيح داده و تعريف كنيد.

3) رنگ سلول ها چگونه است ؟

4)ارگانيسمه اي موجود را بر اساس واكنش گرم تقسيم بندي كنيد .(گرم مثبت يا گرم منفي) .

رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم از مخلوطی از استافیلوکوک اورئوس (کوکسی خوشه ای گرم مثبت بنفش) و اشریشیا کلی (میله ای گرم منفی صورتی)

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و همچنین میتوانید درباره رنگ آمیزی اسیدفست مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من