220px-Hemocytometer_with_gloved_hand

شمارش میکروارگانیسم ها به روش مستقیم

شمارش میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه میکروبیولوژی کاربرد بسیاری دارد و هر میکروبیولوژیستی باید روش های مختلف آن را بداند. در مقالات قبل درباره انواع محیط کشت و نحوه جداسازی میکروارگانیسم ها از محیط های مختلف توضیح داده شد. در این مقاله آزمایشگاه همکار غذا و دارو، پویاژن آزما تولید کننده انواع کیت استخراج DNA و محصولات بیوتکنولوژی، تلاش کرده تا یکی از روش های شمارش میکروارگانیسم ها را آموزش دهد.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید. 

09101438051
021404436-7

کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

شمارش تعداد ميكروارگانيسم ها

هدف : تعيين تعداد  سلول هاي زنده در نمونه هاي باكتريايي

اصول شمارش میکروارگانیسم ها

مطالعاتي كه بمنظور بررسي موادي چون غذا، آب، شير، كشت باكتري در محيط مايع جهت توليدات صنعتي ودر برخي موارد، هوا صورت مي گيرد نيازمند شمارش كمي ميكروارگانيسم ها در اين مواد است . براي اين منظور از روش هاي مختلفي شامل:

1- شمارش مستقيم ميكروسكوپي

2- شمارشگر الكترونيكي سلول

3- روش هاي شيميايي بمنظور تعيين توده سلولي يا تراكم آن

4- روش هاي كدورت سنجي براي تعيين افزايش توده سلولي

5- روش كشت رقت هاي پشت سر هم در پليت استفاده مي شود

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

شمارش ميكروسكوپي مستقيم

استفاده از لام مخصوص شمارش:

در اين روش از لام هاي بخصوصي كه شبيه به لام توما (Thoma) هستند استفاده مي شود. قطر اين لام ها نبايد زياد باشد زيرا در اين حالت تنظيم نمونه هنگام استفاده از عدسي هاي شيئي قوي با اشكال توام مي شود.

در وسط اين نوع لام ها قسمتي وجود دارد كه به اندازه 0/02 ميلي متر از ساير قسمت هاي لام پايين تر است. در قسمت فرو رفته لام يك ميلي متر مربع به 400 مربع كوچك كه سطح هر كدام 0/0025 ميلي متر مربع است تقسيم شده است. پس از قرار دادن لامل بر سطح لام ، حجم هر كدام از مكعب مستطيل هاي كوچك برابر با 0/0000005 ميلي ليتر است.

شمارش باكتری ها به كمك اين نوع لام به اين صورت است كه ابتدا دو قطره از محلول 40% فرمالدئيد به نمونة مورد آزمايش موجود در لولة آزمايش اضافه كرده و آن را كاملاً به هم مي زنند. سپس براي اينكه عمل شمارش به نحو بهتري انجام گيرد، چند قطره محلول 1/0% آبي متيلن براي رنگ شدن باكتري ها به محلول مورد نظر اضافه مي شود. پس از تميز كردن لام و لامل، به كمك يك لوپ تميز كمي از سوسپانسيون باكتري را در وسط لام و در قسمت فرورفته قرار داده و بعد لامل را بر روي آن قرار مي دهند.

بخش های مختلف لام توما

قطره سوسپانسيون نبايد زياد بزرگ و يا كوچك باشد و بطور كلي مقدار آن بايد به صورتي باشد كه پس از قرار گرفتن لامل بر روي سطح لام مقدار كمي از محلول از محفظة وسط خارج سده ودر شيارهاي اطراف محفظه وارد شود. در هر حال تمام قسمت داخلي محفظة وسط لام بايد پر از سوسپانسيون باكتري باشد.

پس از قرار دادن لام در زير ميكروسكوپ براي بهتر ديده شدن باكتري ها، ديافراگم كندانسور را كمي بسته و بعد تعداد باكتري ها را در خانه هاي كوچك شمارش كنيد چنانچه باكتري هاي موجود در خانه هاي زيادتري را شمارش كنيد، دقت كار شما بيشتر بوده و از نظر آماري به تعداد واقعي باكتري ها نزديك خواهد بود. تعداد باكتري هاي موجود در خانه ها نببيد خيلي زياد باشند زيرا در اين حالت شمارش آن ها با اشكال تواَم مي شود.

شمارش میکروارگانیسم ها

شمارش میکروارگانسم ها بصورت مستقیم

 

در صورت زياد شدن تعداد باكتري ها محلول اوليه را رقيق كرده و ضريب رقت را يادداشت كنيد. براي اينكه يك باكتري دو بار شمارش نشود ، باكتري هاي موجود بر روي ضلع بالايي و طرف راست هر مربع را جزء همان مربع به حساب آورده و در آن مربع شمارش كنيد.

براي محاسبة تعداد باكتريهاي موجود در سوسپانسيون اصلي بايد ابتدا تعداد باكتري هاي موجود در يك خانة كوچك محاسبه شود. براي اين عمل ابتدا مجموع باكتريهاي شمارش شده در خانه هاي كوچك را بر تعداد خانه هاي كوچكي كه باكتري هاي آن ها شمارش شده اند تقسيم كنيد. مثلاً تعداد باكتريهاي موجود در يك خانة كوچك (n) در شكل برابر با :

2/9 = 16÷ 46 = n

حجم هر كدام از مكعب مستطيل هاي كوچك برابر با 0/00000005 سانتي متر مكعب (ميلي ليتر) است، بنابر اين در اين حجم n باكتري ( در اين مثال 2/9=n ) موجود است وتعداد باكتري هاي موجود در يك ميلي ليتر از محلول اوليه كه بر روي لام با يك تناسب به صورت زير محاسبه مي شود:

10 × 5/8 = 10 × 0/58 = 10 × (5 ÷ 2/9) = ( 10 × 5 ) ÷ 2/9

براي محاسبة تعداد كل باكتري هاي موجود در محلول اوليه و اصلي واجد باكتري ها، اين عدد با توجه به ضريب رقت بايد در حجم كل ضرب شود.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

شمارش میکروارگانیسم ها به روش بريد (Breed)

در اين روش از لام بريد كه در وسط آن يك سانتي متر مربع علامت گذاري شده است استفاده مي شود. در اين محل 0/01 ميلي ليتر از محلول مورد آزمايش فرار داده و آن را در حرارت آزمايشگاه خشك مي كنند. پس از خشك شدن آن را با  آبي متيلن رنگ كرده و بوسيله عدسي شيئي ايمرسيون باكتريها را شمارش مي كنند.

در اين شرايط ميدان ديد ميكروسكوپ معمولاً حدود 0/16 ميلي متر است ( در صورتيكه عدسي چشمي 10× باشد ). منطقه اي كه در اين حالت در زير ميكروسكوپ ديده مي شود 2 ميلي متر مربع است.

چون تمام ميدان ديد 100 ميلي متر مربع است ، يك ميدان ديد واجد يك پنج هزارم از 0/01 ميلي ليتر مايع اوليه است. اگر يك باكتري در ميدان ديد رؤيت شود دليل بر وجود 5000 باكتري در 0/01 ميلي ليتر محلول اوليه است ( 500000  باكتري در ميلي ليتر) .

 در اين روش باكتري هاي موجود در چندين ميدان ديد شمارش شده و بعد ميانگين گرفته مي شود. چنانچه عدد ميانگين در 500000 ضرب شود تعداد باكتريهاي موجود در يك ميلي ليتر از نمونه محاسبه مي شود.

عيب اين دولام در اين است تعدا سلول هاي زنده ومرده بطور توام شمارش مي شود و نمي توان تعداد سلول هاي زنده و مرده را از هم تفكيك كرد.

پروتکل شمارش میکروارگانیسم ها

مواد و وسايل لازم

كشت 24-16 ساعتة E.coli يا  B. subtilis يا استافيلوكوك ، سمپلر و نوك سمپلر ، فرمالدئيد 40% محلول 0/1% متيلن بلو ، لام توما

روش: دوقطره فرمالدئيد 40% و چند قطره متيلن بلو به لولة آزمايش سوسپانسيون باكتريايي اضافه كرده و يك قطره از سوسپانسيون را با استفاده از سمپلر بر روي محل مخصوص شمارش لام توما قرار دهيد و سپس يك لامل بر روي سوسپانسيون قرار داده و طبق روش گفته شده تعداد باكتري ها را در چند خانه با استفاده از عدسي 40 يا 100 شمارش كرده و در نهايت تعداد باكتري در هر ميلي ليتر از نمونه را محاسبه كنيد.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و انواع کشت باکتری را یاد گرفته باشید. میتوانید میتوانید درباره بقیه روش های شمارش باکتری ها مطالعه کنید. اگر به میکروبیولوژی صنعتی علاقمندید میتوانید درباره نحوه انتخاب سویه های باکتری برای صنعت نیز مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

یک نظر در “شمارش میکروارگانیسم ها به روش مستقیم

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من