شمارش میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه میکروبیولوژی کاربرد بسیاری دارد و هر میکروبیولوژیستی باید روش های مختلف آن را بداند. در مقالات قبل درباره شمارش میکروارگانیسم ها به روش مستقیم توضیح داده شد. در این مقاله آزمایشگاه همکار غذا و دارو، پویاژن آزما تولید کننده کیت استخراج DNA و محصولات بیوتکنولوژی، تلاش کرده تا انواع دیگر روش های شمارش میکروارگانیسم ها را آموزش دهد.
کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت، از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت.
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
شمارشگر الکترونی سلول ها
روش کولتر کانتر (Coulter counter) نمونه ای از دستگاهی است که شمارش سریع سلول های موجود در سوسپانسیون را مقدور می سازد. مایع حاوی میکروارگانیسم ها در محفظه مخصوصی ریخته و از مجرایی به قطر 10-5 میکرومترعبور می کند که در آن جریان متناوبی از الکتریسیته برقرار است .هر سلول در حین عبور از مجرا، مقاومت الکتریکی جریان را افزایش داده واین مقاومت بصورت الکتریکی ثبت می شود. میکروارگانیسم های شمارش شده در این روش مشتمل برانواع زنده و غیر زنده است.
دستگاه شمارش الکترونی سلول ها
روش های شیمیایی
منظور از رشد سلول، افزایش اجزاء داخلی سلول است، بنابر این با تعیین میزان افزایش پروتئین ویا اسید نوکلئیک موجود در سلول ها می توان به میزان رشد یا تعداد آن ها پی برد. همچنین در این ارتباط می توان وزن خشک سلول را در یک کشت یکنواخت تعیین نمود و همچنین با اندازه گیری میزان اکسیژن مصرفی (جذب اکسیژن) یا دی اکسید کربن تولید شده می توان مقدار رشد را تعیین کرد.
شمارش میکروارگانیسم ها به روش کدورت سنجی (اسپکتروفوتومتری)
شمارش باکتری با اسپکتروفتومتر
کدورت افزایش یافته در یک محیط کشت معیار رشد است . در این روش مقدار نوری که از محیط حاوی سلولها عبور میکند متناسب با تعداد سلولهای موجود درآن محیط است . با افزایش تعداد جمعیت میکروبی، میزان نور عبوری کاهش می یابد . کاهش انرژی نورانی ارتباط مستقیمی با کاهش جریان الکتریکی برقرارشده در گا لوا نومتر دستگاه اسپکتروفوتومتر دارد . باوجودیکه این روش سریع انجام می شود ولی حساسیت آن به حدود 10 میلیون سلول در سوسپانسیون میکروبی محدود می شود.
دستگاه اسپکتوفتومتر برای بررسی میزان رشد و تعداد میکروارگانیسم ها نیز استفاده میشود
برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.
روش کشت رقت های پشت سر هم در پلیت
در میکروبیولوژی پزشکی و صنعتی، تعیین سلول های زنده اهمیت دارد برای حصول این نتیجه می توان از روش رقت سریال درپلیت حاوی اگار استفاده کرد .در این روش به کمک سرم فیزیولوژی یا آب استریل، سوسپانسیون میکروبی تهیه شده وبصورت پشت سر هم رقت گیری می شود.
نحوه کار به این صورت است که برحسب مقدار رقتی که موردنیاز است ، لولة آزمایش تهیه می شود . مقدار مشخصی از نمونه مورد بررسی را وارد یک لوله آزمایش حاوی چند میلی لیتر آب مقطر کرده، حجم را بهml 10 می رسانیم. لوله ها را در کنار یکدیگر، درون رک قرار می دهیم. به این لوله ها باید قبلا مقدار ml 9 آب مقطر اضافه شده ودر اتوکلاو استریل می شود.
از لوله نمونه بکمک پیپت ml 1 از نمونه را به لوله دوم وارد می کنیم وبا بالا وپایین کشیدن آب توسط پیپت، یک سوسپانسیون همگن تهیه می کنیم .این عمل برای لوله های بعدی نیز صورت می گیرد ودر نهایت ml 1 از لوله آخر را خارج کرده و دور می ریزیم . از رقتهای آخر برای کشت در محیط پلیت آگار دار استفاده می شود.
مقدار ml 1 از این لوله ها ی بارقت انتهایی را به پلیت وارد کرده، محیط نوترینت آگارذوب شده ( تا دمای حدود 45 درجه ) را به پلیت می افزایند. سپس درب پلیت را گذاشته و پلیت را به آرامی برروی میز بطور دورانی حرکت می دهند تا میکرو ارگانیسم ها بطور یکنواخت در آن پخش گردند. سپس آنرا کنار گذاشته تا محیط کشت سرد و جامد شود. سپس تمام پلیتها انکوبه می شوند. بعد از یک شب گرما گذاری، میتوان به کمک کلنی کانتر ویا دستگاه ویژه الکتریکی تعداد سلول ها را بد ست آورد. بمنظور شمارش ازپلیت هایی استفاده میشود که تعداد کلنی های آنها بین 300 – 30 عدد باشد. تعداد کل میکروبها را از فرمول زیر محاسبه میکنند.
مراحل شمارش تعداد باکتری های زنده در مقدار مشخصی از هر نمونه
فرمول محاسبه تعداد باکتری ها
N = تعداد میکروب ها در یک گرم یا ml 1 نمونه اولیه.
∑C = مجموع کلنی های شمارش شده ( بین 300 – 30 ). ∑C
n 1 = تعداد پلیتهای اولین رقت قابل شمارش. N=—————————
n2 = تعداد پلیتهای دومین رقت قابل شمارش. ( n1 + 0.1n2) d
d = ضریب رقت اولین سری قابل شمارش.
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
محاسن این روش شمارش میکروارگانیسم ها
- فقط سلول های زنده شمارش می شوند.
- کلنی ها بطور مجزا از هم رشد می کنند ، که می توان آنرا بصورت کشت خالص در آورد .
معایب این روش
- مدت طولانی آزمایش ( یک شبانه روزانکوبه گذاری )
- در این روش از لوله ها و پلیت های زیادی استفاده می شود.
- بدلیل افزایش مراحل کار، احتمال خطا بالا میرود.
پروتکل شمارش باکتری ها به روش زنده
مواد و وسایل لازم
- کشت 24-16 ساعتة E.coli ،
- برای هر گروه دانشجویی 6 لوله کشت حاوی ml 20 نوترینت آگار عمیق وهفت لوله حاوی ml 9 آب استریل.
لوازم مورد نیاز
صفحه داغ. حمام آب، ترمومتر ( د ما سنج، رک ( rack ) لوله کشت، پیپت های سرولوژیک ml 1 ، پلیتهای استریل، کلنی شمار، شمارشگر دستی، محلول ضدعفونی کننده در یک ظرف ml 500
شمارش کلونی ها به روش دستی
مراحل شمارش باکتری ها به روش زنده
- لوله آگار عمیقی را درون یک حمام آب قرارداده و مجموعه را روی یک صفحه داغ قراردهید . دما را در 100 درجه سانتیگراد تنظیم کنید تا تمام آگار ذوب شود . حمام آب را از روی صفحه داغ برداشته وبگذارید دمای محیط تا 45 درجه پایین بیاید . حرارت را توسط یک دما سنج کنترل کنید .حمام آب را دوباره روی صفحه داغ قرار داده ودما را در 45 درجه سانتیگراد تنظیم کنید تا برای مدتی که کارهای دیگر انجام می شود، همچنان مایع باقی بماند .
- لوله کشت E.coli را با شماره یک، وهفت لوله آب استریل ml 9 را با شماره های 2 تا 8 مشخص کنید . این لوله ها را در یک رک قراردهید . پلیتها را بصورت 3B, 3A , 2B , 2A ,1B , 1A نامگذاری کنید .
- با تکان دادن لوله ها، کشت E . coli ( لوله شماره 1 ) را بخوبی مخلوط کنید .
- بکمک یک پیپت استریل، ویا حفظ شرایط آسپتیک، ml 1 از سوسپانسیون باکتری را وارد لوله حاوی آب ( شماره 2) کنید. پیپت را درظرف حاوی ماده ضدعفونی کننده قرار دهید . این کشت تا ده برابر رقیق شده است.
- با یک پیپت جدید لوله شماره 2 را مخلوط کرده و ml 1 از آنرا در لوله شماره 3 منتقل کنید . این پیپت را کنار بگذارید . این محیط کشت در حد 100 برابررقیق شده است.
- با یک پیپت تازه محلول شماره 3 را کاملا مخلوط کرده، ml 1 از آنرا به لوله شماره 4 اضافه کنید . پیپت را کنار بگذارید.( رقت 1000 برا بر)
- با یک پیپت تازه محلول شماره 4 را کاملا مخلوط کرده، ml 1 از آنرا به لوله شماره 5 اضافه کنید . پیپت را کنار بگذارید ( رقت 10000 برابر).
- با یک پیپت تازه محلول شماره 5 را کاملا مخلوط کرده ml 1/0 از سوسپانسیون را به پلیت 1A منتقل کنید . این پیپت را دوباره وارد لوله شماره 5 کرده وml 1 از آنرا وارد لوله شماره 6 کنید . این پیپت را کنار بگذارید . این کشت دارای رقت 100000 برابر است
- با یک پیپت تازه محلول شماره 6 را مخلوط کنید وml 1 از این سوسپانسیون را به پلیت 1B انتقال دهید . پیپت را دوباره وارد لوله شماره 6 کرده و ml 0/1 از آنرا به پلیت 2A منتقل کنید . این پیپت را یکباردیگر به لوله شماره 6 وارد کرده ، ml 1 از آنرا وارد لوله شماره 7 کنید . این پیپت را کنار بگذارید . این کشت دارای رقت 100000 برابر است .
- بایک پیپت تازه، لوله شماره 7 را مخلوط کنید وبا ml 1 از این سوسپانسیون را به پلیت 2B انتقال دهید این پیپت را به لوله شماره 7 برگردانید و ml 1 /0 از آنرا وارد پلیت 3A کنید . یکبار دیگر این پیپت را وارد لوله هفت کرده وml 1 از آنرا به لوله هشت وارد کنید . این پیپت را کنار بگذارید . این کشتها دارای رقت 10000000 است .
- با یک پیپت دیگر، لوله شماره 8 را مخلوط کرده، وml 1 از این سوسپانسیون را به پلیت 3B انتقال دهید . این پیپت را کنار بگذارید . حال رقت گیری کامل شده است .
- مطمئناً باید حرارت محیط کشت 45 درجه سانتیگراد باشد. یک لوله را ازحمام آب خارج کرده، آنرا وارد پلیت 1A کنید، و پلیت را به آرامی بچرخانید تا مطمئن شوید سلولها بطور همگن در محیط کشت پخش شده اند.
- مرحله 12 راتکرار کنید تا محیط کشت را به پلیتهای 3B, 3A , 2B, 2A , 1B وارد کنید.
- بمحض اینکه آگارسفت شد، پلیتها را در 37 درجه سانتیگراد، بمدت 24 ساعت انکوبه کنید.
دستگاه کلونی کانتر برای شمارش کلونی ها
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
مشاهدات و نتایج شمارش میکروارگانیسم ها
1 – به کمک کلنی کانتر و شمارشگر مکانیکی دستی، تمام کلنی های موجود در هر پلیت را بشمرید. پلیت های بیشتر از 300 کلنی بصورت TNTC ( Too Numerous To Count) بیان می شود و نمی توان آنرا شمارش کرد . پلیتهای کمتراز 30 کلنی بصورت TFTC (TooFall To Count ) بیان میشود . فقط کلنی های 300 – 30 شمارش می شوند . توجه داشته باشید که تمام کلنی های سطحی را شمارش نمایید.
2 – تعداد میکروب ها از ضرب تعداد کلنی های شمارش شده در رقت پلیت به دست می آید.
فاکتور رقت × تعداد کلنی ها = تعدادسلول در هر ml
مثال 1 ) تعداد کلنی بر روی سطح پلیت : 50 عدد
فاکتور رقت : ( 1:1×6^10 )
حجم رقت اضافه شده به پلیت = ml 1
ml / سلول 0000000 5 = 0000000 1 × 50
مثال 2 ) تعداد کلنی بر روی سطح پلیت پلیت : 50 عدد ، فاکتور رقت : ( 1:1×6^10)
حجم رقت اضافه شده به پلیت = ml 0/1 = 10* 100000 *50
3 – مشاهدات ومقادیر باکتریایی شمارش شده در هر ml نمونه را در یک جدول وارد کنید.
4 – از آنجا که مقادیر بد ست آمده با هم متفاوت هستند مقدار متوسط تعداد باکتری را بد ست آورید.
امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و بتوانید به راحتی شمارش باکتری ها و انواع کپک و مخمر را انجام دهید. اگر به میکروبیولوژی صنعتی علاقمندید میتوانید درباره نحوه انتخاب سویه های باکتری برای صنعت نیز مطالعه کنید.
شرکت دانش بنیان پویا ژن آژما – تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر
