شمارشگر کلونی

روش های شمارش میکروارگانیسم ها

شمارش میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه میکروبیولوژی کاربرد بسیاری دارد و هر میکروبیولوژیستی باید روش های مختلف آن را بداند. در مقالات قبل درباره شمارش میکروارگانیسم ها به روش مستقیم توضیح داده شد. در این مقاله آزمایشگاه همکار غذا و دارو، پویاژن آزما تولید کننده انواع کیت استخراج DNA و محصولات بیوتکنولوژی، تلاش کرده تا انواع دیگر روش های شمارش میکروارگانیسم ها را آموزش دهد.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید. 

09101438051
021404436-7

کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

شمارشگر الكتروني سلول ها

روش كولتر كانتر (  Coulter counter  ) نمونه اي از دستگاهي است كه شمارش سريع سلول هاي موجود در سوسپانسيون را مقدور مي سازد. مايع حاوي ميكروارگانيسم ها در محفظه مخصوصي ريخته و از مجرايي به قطر 10-5 ميكرومترعبور مي كند كه در آن جريان متناوبي از الكتريسيته برقرار است .هر سلول در حين عبور از مجرا، مقاومت الكتريكي جريان را افزايش داده واين مقاومت بصورت الكتريكي ثبت مي شود. ميكروارگانيسم هاي شمارش شده در اين روش مشتمل برانواع زنده و غير زنده است.

شمارش سلول

دستگاه شمارش الکترونی سلول ها

 

روش هاي شيميايي

منظور از رشد سلول، افزايش اجزاء داخلي سلول است، بنابر اين با تعيين ميزان افزايش پروتئين ويا اسيد نوكلئيك  موجود در سلول ها مي توان به ميزان رشد يا تعداد آن ها پي برد. همچنين در اين ارتباط مي توان وزن خشك سلول را در يك كشت يكنواخت تعيين نمود و همچنين با اندازه گيري ميزان اكسيژن مصرفي (جذب اكسيژن) يا دي اكسيد كربن توليد شده مي توان مقدار رشد را تعيين كرد.

شمارش ميكروارگانيسم ها به روش كدورت سنجي ( اسپكتروفوتومتري)

كدورت افزايش يافته در يك محيط كشت معيار رشد است . در اين روش مقدار نوري كه از محيط حاوي سلولها عبور ميكند متناسب با تعداد سلولهاي موجود درآن محيط است . با افزايش تعداد جمعيت ميكروبي، ميزان نور عبوري كاهش  مي يابد . كاهش انرژي نوراني ارتباط مستقيمي با كاهش جريان الكتريكي برقرارشده در گا لوا نومتر دستگاه اسپكتروفوتومتر دارد . باوجوديكه اين روش سريع انجام مي شود ولي حساسيت آن به حدود 10 ميليون سلول در سوسپانسيون ميكروبي محدود مي شود.

اسپکتوفوتومتر

دستگاه اسپکتوفتومتر برای بررسی میزان رشد و تعداد میکروارگانیسم ها نیز استفاده میشود

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

روش كشت رقت هاي پشت سر هم در پليت

  در ميكروبيولوژي پزشكي و صنعتي، تعيين سلول هاي زنده اهميت دارد براي حصول اين نتيجه مي توان از روش رقت سريال درپليت حاوي اگار استفاده كرد .در اين روش به كمك سرم فيزيولوژي يا  آب استريل، سوسپانسيون ميكروبي تهيه شده وبصورت پشت سر هم رقت گيري مي شود.

نحوه كار به اين صورت است كه برحسب مقدار رقتي كه موردنياز است ، لولة آزمايش تهيه مي شود . مقدار مشخصي از نمونه مورد بررسي را وارد يك لوله آزمايش حاوي چند ميلي ليتر آب مقطر كرده، حجم را بهml  10 مي رسانيم. لوله ها را در كنار يكديگر، درون  رك قرار مي دهيم. به اين لوله ها بايد قبلا مقدار ml 9 آب مقطر اضافه شده ودر اتوكلاو استريل مي شود.

از لوله نمونه بكمك پيپت ml 1 از نمونه را به لوله دوم وارد مي كنيم وبا بالا وپايين كشيدن آب توسط پيپت، يك سوسپانسيون همگن تهيه مي كنيم .اين عمل براي لوله هاي بعدي نيز صورت مي گيرد ودر نهايت ml 1 از لوله آخر را خارج كرده و دور مي ريزيم . از رقتهاي آخر براي كشت در محيط پليت آگار دار استفاده مي شود.

مقدار ml 1 از اين لوله ها ي بارقت انتهايي را به پليت وارد كرده، محيط نوترينت آگارذوب شده ( تا دماي حدود 45 درجه ) را به پليت مي افزايند. سپس درب پليت را گذاشته و پليت را به آرامي برروي ميز بطور دوراني حركت مي دهند تا ميكرو ارگانيسم ها بطور يكنواخت در آن پخش گردند. سپس آنرا كنار گذاشته تا محيط كشت سرد و جامد شود. سپس تمام پليتها انكوبه مي شوند. بعد از يك شب  گرما گذاري، ميتوان به كمك كلني كانتر ويا دستگاه ويژه الكتريكي تعداد سلول ها را بد ست آورد. بمنظور شمارش  ازپليت هايي استفاده ميشود كه تعداد كلني هاي آنها بين 300 – 30 عدد باشد. تعداد كل ميكروبها را از فرمول زير محاسبه ميكنند.

شمارش کلونی

مراحل شمارش تعداد باکتری های زنده در مقدار مشخصی از هر نمونه

N = تعداد ميكروب ها در يك گرم يا ml 1 نمونه اوليه.

∑C  = مجموع كلني هاي شمارش شده ( بين 300 – 30 ).                               ∑C   

 n 1   =   تعداد پليتهاي اولين رقت قابل شمارش.                          N=—————————

n2=  تعداد پليتهاي  دومين رقت قابل شمارش.                                   ( n1 + 0.1n2) d                              

d   =   ضريب رقت اولين سري قابل شمارش.

محاسن اين روش شمارش میکروارگانیسم ها

  • فقط سلول هاي زنده شمارش مي شوند.
  • كلني ها بطور مجزا از هم رشد مي كنند ، كه مي توان آنرا بصورت كشت خالص در آورد .

معا يب این روش شمارش میکروارگانیسم ها

    1 )  مدت طولاني آزمايش ( يك شبانه روزانكوبه گذاري )

   2 )   در اين روش از لوله ها و پليت هاي زيادي استفاده مي شود.

  3 )   بدليل افزايش مراحل كار، احتمال خطا بالا ميرود.

   پروتکل شمارش باکتری ها به روش زنده

مواد و وسايل لازم

كشت 24-16 ساعتة E.coli ،

براي هر گروه دانشجويي 6 لوله  كشت حاوي ml 20 نوترينت آگار عميق وهفت لوله حاوي ml 9 آب استريل.

لوازم مورد نياز

صفحه داغ. حمام آب، ترمومتر ( د ما سنج، رك ( rack ) لوله كشت، پيپت هاي سرولوژيك ml 1 ، پليتهاي استريل، كلني شمار، شمارشگر دستي، محلول ضدعفوني كننده در يك ظرف ml 500

شمارش کلونی

شمارش کلونی ها به روش دستی

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

پرتکل

     1 – لوله آگار عميقي را درون يك حمام آب قرارداده و مجموعه را روي يك صفحه داغ قراردهيد . دما را در 100 درجه سانتيگراد تنظيم كنيد تا تمام آگار ذوب شود . حمام آب را از روي صفحه داغ برداشته وبگذاريد دماي محيط تا 45 درجه پايين بيايد . حرارت را توسط يك دما سنج كنترل كنيد .حمام آب را دوباره روي صفحه داغ قرار داده ودما را در 45 درجه سانتيگراد تنظيم كنيد تا براي مدتي كه كارهاي ديگر انجام مي شود، همچنان مايع باقي بماند .

    2 –  لوله كشت E.coli  را با شماره يك، وهفت لوله آب استريل ml 9 را با شماره هاي 2 تا 8 مشخص كنيد . اين لوله ها را در يك رك قراردهيد . پليتها را بصورت     3B, 3A , 2B , 2A ,1B , 1A   نامگذاري كنيد .

3 – با تكان دادن لوله ها، كشت E . coli ( لوله شماره 1 ) را بخوبي مخلوط كنيد .

4 –  بكمك يك پيپت استريل، ويا حفظ شرايط آسپتيك، ml 1 از سوسپانسيون باكتري را وارد لوله حاوي آب ( شماره 2) كنيد. پيپت را درظرف حاوي ماده ضدعفوني كننده قرار دهيد . اين كشت تا ده برابر رقيق شده است.

5 – با يك پيپت جديد لوله شماره 2 را مخلوط كرده و ml 1 از آنرا در لوله شماره 3 منتقل كنيد . اين پيپت را كنار بگذاريد . اين محيط كشت در حد 100 برابررقيق شده است.

6 –  با يك پيپت تازه محلول شماره 3 را كاملا مخلوط كرده، ml 1 از آنرا به لوله شماره 4 اضافه كنيد . پيپت را كنار بگذاريد.( رقت 1000  برا بر)

7 – با يك پيپت تازه محلول شماره 4 را كاملا مخلوط كرده، ml 1 از آنرا به لوله شماره 5 اضافه كنيد . پيپت را كنار بگذاريد ( رقت  10000  برابر).

8 –  با يك پيپت تازه محلول شماره 5 را كاملا مخلوط كرده ml 1/0 از سوسپانسيون را به پليت 1A منتقل كنيد . اين پيپت را دوباره وارد لوله شماره 5 كرده وml 1 از آنرا وارد لوله شماره 6 كنيد . اين پيپت را كنار بگذاريد . اين كشت داراي رقت 100000 برابر  است

9 – با يك پيپت تازه محلول شماره 6 را مخلوط كنيد وml 1 از اين سوسپانسيون را به پليت 1B انتقال دهيد . پيپت را دوباره وارد لوله شماره 6 كرده و ml 0/1 از آنرا به پليت 2A منتقل كنيد . اين پيپت را يكبارديگر به لوله شماره 6  وارد كرده ،  ml 1 از آنرا وارد لوله شماره 7 كنيد . اين پيپت را كنار بگذاريد .  اين كشت داراي رقت 100000 برابر است .

10 – بايك پيپت تازه، لوله شماره 7 را مخلوط كنيد وبا ml 1 از اين سوسپانسيون را به پليت 2B انتقال دهيد اين پيپت را به لوله شماره 7 برگردانيد و ml 1 /0 از آنرا وارد پليت 3A كنيد . يكبار ديگر اين پيپت را وارد لوله هفت كرده وml 1 از آنرا به لوله هشت وارد كنيد . اين پيپت را كنار بگذاريد . اين كشتها داراي رقت 10000000 است .

11- با يك پيپت ديگر، لوله شماره 8 را مخلوط كرده، وml 1 از اين سوسپانسيون را به پليت 3B انتقال دهيد . اين پيپت را كنار بگذاريد . حال رقت گيري كامل شده است .

12- مطمئناً بايد حرارت محيط كشت 45 درجه سانتيگراد باشد. يك لوله را ازحمام آب خارج كرده، آنرا وارد پليت 1A كنيد، و پليت را به آرامي بچرخانيد تا مطمئن شويد سلولها بطور همگن در محيط كشت پخش شده اند.

13 – مرحله 12 راتكرار كنيد تا محيط كشت را به پليتهاي 3B, 3A , 2B, 2A , 1B وارد كنيد.

14 – بمحض اينكه آگارسفت شد، پليتها را در 37 درجه سانتيگراد، بمدت 24 ساعت انكوبه كنيد.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

  

شمارش کلونی

دستگاه کلونی کانتر برای شمارش کلونی ها

       مشاهدات و نتا یج شمارش میکروارگانیسم ها

1 – به كمك كلني كانتر و شمارشگر مكانيكي دستي، تمام كلني هاي موجود در هر پليت را بشمريد. پليت هاي بيشتر از 300 كلني بصورت  TNTC   ( Too Numerous  To  Count)  بيان مي شود و نمي توان آنرا شمارش كرد . پليتهاي كمتراز 30 كلني بصورت TFTC (TooFall To Count ) بيان ميشود . فقط كلني هاي 300 – 30 شمارش مي شوند . توجه داشته باشيد كه تمام كلني هاي سطحي را شمارش نماييد.

2 – تعداد ميكروب ها از ضرب تعداد كلني هاي شمارش شده در رقت پليت بد ست مي آيد.

فاكتور رقت  ×  تعداد كلني ها =   تعدادسلول در هر ml

مثال 1 ) تعداد كلني بر روي سطح پليت : 50 عدد

فاكتور رقت : ( 1:1×6^10  )

حجم رقت اضافه شده به پليت  =   ml  1

ml / سلول 0000000 5  =  0000000 1 × 50

مثال 2 ) تعداد كلني بر روي سطح پليت پليت : 50 عدد ، فاكتور رقت :  ( 1:1×6^10)

حجم رقت  اضافه شده به پليت =    ml    0/1     = 10*  100000 *50                   

3 –  مشاهدات ومقادير باكتريايي شمارش شده در هر ml نمونه را در يك جدول وارد كنيد.

4 – از آنجا كه مقادير بد ست آمده با هم متفاوت هستند مقدار متوسط تعداد باكتري را بد ست آوريد.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و بتوانید به راحتی شمارش باکتری ها و انواع کپک و مخمر را انجام دهید. اگر به میکروبیولوژی صنعتی علاقمندید میتوانید درباره نحوه انتخاب سویه های باکتری برای صنعت نیز مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

سرتیترها

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه