آنتی بیوگرام – بررسی مقاومت باكتری نسبت به آنتی بوتيک

آنتی بیوتیک ها مواد شیمیایی هستند که بوسیله باکتری ها ، آکتینومیست ها و قارچ های خاص تولید می شوند و میکروارگانیزم های دیگر را با مکانیزم های مختلف از بین برده یا رشد آن ها را متوقف می کنند. در بیماری های عفونی بیشتر اوقات برای پزشک لازم است با شناختن ارگانیسمی که باعث آلودگی بیمار شده و سپس بررسی حساسیت عامل عفونت نسبت به آنتی بیوتیک ها، برای درمان بیماری اقدام نماید. موتانت های مقاوم باکتری ها معمولاً در اثر مصرف نادرست آنتی بیوتیک یا به کار بردن آنتی بیوتیک نامناسب پیش می آید. در این مقاله شرکت دانش بنیان پویاژن آزما و آزمایشگاه همکار سازمان غذا و دارو قصد دارد بطور مفصل پروتکل تست آنتی بیوگرام را بررسی کند.

کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

تست حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ها

روش استاندارد شده Kirby – Bauer در آزمایشگاه های تشخیصی برای تست حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ها به کار می رود که در این روش  بعد از پخش میکروب در سطح پلیت حاوی محیط مخصوص و قرار دادن دیسک های آنتی بیوتیک بوسیله دستگاه مخصوص Antibiotic disk dispensers (یا پنس) و قرار دادن پلیت ها در حرارت 37-30 درجه به مدت 48 ساعت ، نتایج را با اندازه گیری قطر هاله به کمک خط کش بر حسب میلی متر و مقایسه با جدول استاندارد شد ه گزارش می کنند.

مقدار هاله ایجاد شده به عوامل زیر بستگی دارد:

• توانایی و سرعت انتشار آنتی بیوتیک به داخل محیط و واکنش آن با ارگانیسم مورد نظر
• تعداد ارگانیسم های تلقیح شده
• سرعت رشد ارگانیسم
• درجه حساسیت ارگانیسم به آنتی بیوتیک

سنجش حساسیت باکتری ها به آنتی بیوتیک ها

هدف: آشنا سازی دانشجو با روش بررسی حساسیت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها

مواد لازم:

سوسپانسیونی از باکتریهای E. coli ، S. aureus و سودوموناس با OD=0.1 در طول موج nm 600

دو پلیت مولر هینگتون برای هر گروه دانشجویی ، دیسک آنتی بیوتیک های پنی سیلین، تتراسیکلین ، کلرامفنیکل ، جنتامیسین ، ونکومایسین ، سولفونامید و …

وسایل مورد نیاز:

پنس یا چوب دیسک گذاری ، شعله ، سوآپ پنبه ای استریل ، خط کش میلی متری

دیسک های آنتی بیوتیک

پروتکل تست آنتی بیوگرام

1. پلیت ها را بطور مستقیم به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه کنید و درب آن را طوری تنظیم کنید که بطور جزئی باز باشد.
2. روی درب پلیت ها نام ارگانیسم تلقیح شونده و مشخصات خود را درج کنید.
3. با روش استریل تمام پلیت ها را بصورت زیر تلقیح کنید:
   1. A . سوآپ پنبه ای استریل را وارد کشت باکتری کرده و با فشار دادن آن به سطح داخلی لوله کشت مقداری از مایع را از پنبه آن خارج کنید.
   2. B . سوآپ را بر روی سطح پلیت ابتدا بطور افقی و سپس بطور عمودی بکشید تا مطمئن شوید که تمام سطح آن را تلقیح کرده اید.
4. پنج دقیقه صبر کنید تا سطح پلیت ها خشک شود.
5. به کمک پنس هایی که با الکل و شعله استریل شده اند ، دیسک ها را به فواصل مشخص از هم بر روی سطح پلیت قرار دهید. دقت کنید که فاصله دیسک ها از یکدیگر و جدار پلیت به یک اندازه باشد( می توانید قبلاً محل قرار دادن دیسک های آنتی بیوگرام را با ماژیک بر روی پشت پلیت مشخص کنید).
6. با پنس استریل دیسک ها را فشار دهید تا به سطح آگار بچسبند. مواظب باشید که دیسک ها وارد محیط نشوند.
7. پلیت ها را در 37 درجه به مدت 48 -24 ساعت قرار دهید.

مشاهدات و نتایج تست آنتی بیوگرام

• پلیت ها را از بابت وجود یا عدم هاله بازدارندگی در اطراف هر دیسک بررسی کنید.
• به کمک خط کش میلی متری اندازه هاله ها را بطور دقیق اندازه گیری کرده و نتایج را در یک جدول ثبت کنید.
• نتایج خود را با جدول استاندارد مقایسه کنید و وضعیت پاسخ باکتری به آنتی بیوتیک را بصورت R (مقاوم) ، I (حد واسط) و یا S (حساسیت) نشان دهید.
• برای هر آنتی بیوتیک طیف عمل آن را بصورت “وسیع” یا “محدود” مشخص کنید.
• نوع باکتری حساس را از لحاظ گرم مثبت بودن یا گرم منفی بودن مشخص کنید.

باکتری هایی که نسبت به میزان حساسیت به آنتی بیوتیک خاص تا شعاعی مشخص در اطراف دیسک آنتی بیوتیک رشد نکرده اند.

نمونه ای از نتایج تست آنتی بیوگرام

اثر سینرژیک ترکیب داروها

هدف: آشنا سازی دانشجو با تکنیک تعیین ترکیبات سینرژیک

استفاده همزمان ترکیب دو یا چند عامل ضد میکروبی در پزشکی کاربرد روز افزون دارد. با این روش شیوع مقاومت میکروبی کاهش خواهد یافت. فعالیت سینرژیسمی زمانی مفهوم دارد که مجموع اثرات داروهای مورد استفاده در حالت ترکیبی بطور قابل توجهی از مجموع اثرات آنها در حالت مستقل بیشتر باشد. وقتی مجموع اثرات دو دارو برابر مجموع اثرات هر یک از این عوامل به تنهایی باشد این حالت را اثر تجمعی گویند.

اساس کار در در تعیین اثر سینرژیسمی با روش Kirby-Bauer شبیه آزمایش اول است به طوریکه فاصله آنها از هم برابر یا کمی بیشتر از نصف مجموع اندازه هاله هر یک از آنها به تنهایی است. بعد از پایان دوره انکوباسیون، اثر تجمعی بصورت وجود دو هاله بازدارنده گی مجزا نمایان می شود در حالت سینرژیسمی دو هاله به هم رسیده و به هم پل می زنند. دو نمونه از حالت سینرژیسمی را می توان در سولفیسوکسازول+ تری متوپریم و تری متوپریم + تتراسایکلین مشاهده کرد.

مواد و وسایل لازم:

مواد و وسایل مورد نیاز مانند آزمایش آنتی بیوگرام می باشد فقط به جای دیسک های ذکر شده از دیسک های تتراسایکلین ، تری متوپریم ، سولفیسوکسازول

پروتکل بررسی اثر سینرژیک ترکیب داروها

• مراحل 4-1 آزمایش بررسی آنتی بیوتیک ها را تکرار کنید
• قسمت مرکزی پلیت را با ماژیک مشخص کرده و طبق روش زیر دیسکها را جاسازی کنید:

1. 1. برای پلیت E.coli و دیسک های تری متوپریم و سولفیسوکسازول ، 12/5 میلی متر از دو طرف مرکز نشان دار شده است.
   2. برای پلیت S. aureus و دیسک های تری متوپریم و تتراسایکلین و همچنین برای پلیت S. aureus و همین دیسک ها mm 14 نسبت به مرکز نشان دار شده.
2. مثل آزمایش آنتی بیوگرام دیسک ها را در جای خود قرار دهید.
3. پلیت ها را در دمای 37 درجه به مدت 48-24 ساعت انکوبه کنید.

مشاهدات و نتایج:

الگوی بازدارندگی هر پلیت را مشخص کنید. هاله های مجزا نشان دهنده اثر تجمعی حال آنکه هاله های بهم رسیده بیانگر اثر سینرژی است.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید درباره نکات کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی مطالعه کنید.