در مقاله قبل درباره تخمیر و فعالیت بتاگالاکتوزیداز بطور مفصل توضیح دادیم. در این مقاله قصد داریم شما را با پروتکل بررسی این مورد در باکتری ها آشنا کنیم.
روش لوله دورهام
مرحله اول
1- 5 لوله حاوی محیط کشت اختصاصی را با نامتان ، تاریخ و نوع محیط کشت علامت گذاری کنید.
2- اولین لوله را با ، E. coli دومی را با سالمونلا تیفی موریوم، سومی را با آلکالیژنز فکالیس، چهارمی را با ساکارومایسس سرویزیه و پنجمی را به عنوان کنترل علامت گذاری کنید.
3- هر لوله را با میکروب مربوطه تلقیح کنید و لوله پنجم را تلقیح نکنید. مراقب باشید در خلال تلقیح لوله ها کج نشده و ضربه نخورند چون ممکن است باعث ایجاد حباب در لوله دورهام شده و پاسخ مثبت کاذب ایجاد گردد. لوله ها را می توان با چرخاندن بین دو کف دست مخلوط کرد.
4- لوله ها را در رک قرار داده و در دمای 35 درجه به مدت 24-48 ساعت بگذارید.
مرحله دوم
1- بطور ایده آل لوله ها باید با احتیاط بین 4-2 ساعت، بعد از 8 و 16 ساعت بررسی شده تا از ایجاد پاسخ منفی کاذب به علت انکوباسیون طولانی مدت جلوگیری گردد.
2- تمام لوله های حاوی محیطهای کشت کربوهیدراتی را از لحاظ تولید اسید (A) تولید اسید و گاز (A/G) بررسی و علامت گذاری کنید. از شکل می توانید به عنوان منبع استفاده کنید.
3- لوله کنترل باید از نظر اسید و گاز منفی باشد و کدورت نیز نداشته باشد.
4- بر اساس مشاهدات خود مشخص کنید کدام یک از میکروارگانیزم ها قادر به تخمیر کدام کربوهیدرات با تولید اسید یا اسید و گاز هستند. نتایج خود را با دانشجویان دیگر که قندهای دیگری استفاده کردند مقایسه کنید.
روش دیسک افتراقی تخمیر قند
مرحله اول
1- پنج لوله حاوی محیط پایه آگار تریپتیک را با نامتان و نوع قند مورد مطالعه علامت گذاری کنید.
2- اولین لوله را با ، E. coli دومی را با سالمونلا کلرا-سویس، سومی را با آلکالیژنز فکالیس، چهارمی را با ساکارومایسس سرویزیه و پنجمی را به عنوان کنترل علامت گذاری کنید.
3- با استفاده از پنس استریل (یا پنسی که در الکل %70 قرار داده شده و سپس با شعله حرارت داده شده)، بطور استریل یک دیسک قند را در هر لوله قرار دهید.
4- هر لوله بجز لوله کنترل را با روش زیر تلقیح کنید. مقدار زیادی باکتری را با سوزن تلقیح (نیدل) برداشته و سپس سوزن را تا عمق 1/3 تا 2/3 محیط آگار دار داخل کنید. این سوزن باید دیسک افتراقی قند را در داخل آگار فرو برد. محیط داخل لوله کنترل باید بوسیله سوزن تلقیح استریل سوراخ گردد.
5- لوله ها به مدت 24 ساعت در 35 درجه قرار داده شود.
مرحله دوم
1- بطور ایده آل لوله ها باید بین 4-2 ساعت و بعد از 8 و 16 ساعت بررسی گردد.
2- تولید اسید بوسیله زرد شدن محیط در اطراف دیسک که اغلب در آگار گسترش می یابد مشخص می گردد. تولید گاز باعث ایجاد حباب و شکاف خوردن آگار می گردد. بخاطر داشته باشید که نتیجه اسید مثبت می تواند با گرماگذاری بیشتر برگردد بنابراین زرد شدن آگار بین 4-2 ساعت نتیجه مثبت است حتی اگر لوله بعد از گرماگذاری طولانی قرمز تا بنفش گردد.
3- نتایج خود را با نتایج دانشجویانی که قندهای دیگری را استفاده کرده اند مقایسه کنید.
دیسک ها یا قرص های ONPG برای تخمیر
0/2ml -1 از %0/85 NaCl استریل یا ( 1 mlحدود 40 قطره با پیپت پاستور) از آب مقطر استریل را در چهار لوله استریل تقسیم کنید.
2- هر لوله را با نام میکروارگانیزمی که قرار است تلقیح شود، نام خود و تاریخ علامت گذاری کنید.
3- یک لوپ پر از میکروارگانیزم را در هر لوله سوسپانسیون کنید.
4- یک دیسک یا قرص ONPGرا در هر تیوب قرار دهید و در 35 درجه قرار دهید.
5- بعد از 20 دقیقه و 4 ساعت لوله ها را بررسی کنید (قرص KEYمی تواند حداکثر تا 6ساعت جواب دهد).
6- آزمایش بتاگالاکتوزیداز مثبت با زرد شدن و عدم تغییر رنگ نشان دهنده منفی بودن است.
7- نتایج را مانند نمونه یادداشت کنید.
تذکرات و نکات احتیاطی
(1) میزان تلقیح در هر لوله باید کم باشد. تلقیح زیاد باعث رشد بیش از اندازه و خنثی شدن محصولات تخمیری اسیدی بوسیله باکتری شده در نتیجه پاسخ منفی کاذب ایجاد می شود.
(2) لوله های تخمیر را بعد از تلقیح ورتکس نکنید چون باعث ورود حباب به داخل لوله دورهام شده و نتیجه کاذب مثبت ایجاد می شود.
جدول درج نتاج تخمیر کربوهیدرات ها
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051
021404436-7
برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.
امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید در مقاله بعدی درباره تست TSI و پروتکل آن مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی درباره آنزیم بتاگالاکتوزیداز مطالعه کنید.
همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.
