یک PCR موفق وابسته به دو جزء حیاتی است؛ بافر بهینه شده ی واکنش و یک آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به دما و با کیفیت (مثل Taq پلیمراز). آنزیم DNA پلیمراز دارای 4 فاکتور مختلف است که با دانستن آن ها می توانیم بهترین آنزیم DNA پلیمراز را برای تحقیق انتخاب کنیم

در این مقاله آزمایشگاه همکار غذا و دارو پویاژن آزما قصد دارد انواع آنزیم های DNA پلیمراز را  معرفی نماید.

اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.

09101438051

02140443676

4 فاکتور موثر در انتخاب DNA پلیمراز

یک) مقاومت به دما

در مرحله ی دناتوراسیون PCR، برای جداسازی دو رشته ی DNA دما تا حدود 95 درجه بالا می رود. آنزیم مورد استفاده باید به قدری قدرت و مقاومت داشته باشد که در این دما قابلیت خود را از دست ندهد. این فاکتور به ترکیبات بافر و pH وابسته است.

دو) نرخ طویل سازی(Extension rate)

به سرعت نوکلئوتید گذاری در هر ثانیه به ازای هر مولکول آنزیم DNA پلیمراز نرخ طویل سازی گویند؛ این فاکتور به دمای طویل سازی، توالی DNA نمونه و ترکیبات موجود در بافر بستگی دارد. پلیمرازهای اولیه، دارای سرعت 1 کیلوباز در دقیقه در دمای 72 درجه بودند؛ در حالی که آنزیم های امروزی سریع تر هستند( حدود 4 کیلوباز در دقیقه.)

سه) وفاداری(Fidelity)

وفادارای یا دقت، خاصیتی ذاتی در DNA پلیمراز است که به جای گذاری نوکلئوتیدهای اشتباه به ازای هر کیلوباز DNA گفته می شود. برای پلیمرازهای استاندارد، وفاداری به قابلیت تشخیص نوکلئوتید اشتباه از درست در حین انجام تکثیر ژن گفته می شود و تحت تاثیر ترکیبات بافر است. پلیمرازهای با وفاداری بالا دقیق تر هستند زیرا دارای قابلیت “تصحیح” می باشند؛ یعنی می توانند نکولئوتید اشتباه را در حین تکثیر قطعه تشخیص داده، حذف و با نوکلئوتید جدید جابه جا کنند.

چهار) فرآیندپذیری(Processivity)

امکان جدا شدن DNA پلیمراز در حین طویل سازی، که نشان دهنده ی میزان نوکلئوتیدهایی است که آنزیم به یک تک رشته متصل می کند، فرآیندپذیری گویند. مثل نرخ طویل سازی، فرآیند پذیری وابسته به ترکیبات بافر (غلظت نمک) و توالی DNA نمونه است. فرآیندپذیری بالا در تکثیر قطعات طویل و بزرگ بسیار مهم است.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

قابلیت های مختلف در این 4 فاکتور، انواع مختلفی از DNA پلیمراز را به ما می دهد.

انواع DNA پلیمراز

1. پلیمرازهای استاندارد مقاوم به دما (Standard thermostable DNA polymerase)

این پلیمرازها، برای انجام PCR معمولی مناسب هستند؛ به طور مثال برای زمانی که می خواهیم محصول تکثیر شده را پس از PCR روی ژل الکتروفورز تشخیص دهیم و یا اندازه ی آن را بدانیم. آنزیم Taq استاندارد یک تک باز آدنین دار به انتهای ‘3 محصول اضافه می کند و این امکان را می دهد که به طور مستقیم محصول را وارد وکتورهای T/A CLONING کنیم. Taq پلیمرازهای جدیدتر، فرآیندپذیری و نرخ طویل سازی دارند اما در عین حال، به خاطر نداشتن قابلیت Proofreading، به منظور تکثیر قطعه های ژن برای کلون، بیان و تحقیقات جهش زایی نباید مورد استفاده قرار گیرند.

2. پلیمراز های هات استارت Hot-start (HS) polymerases))

DNA پلیمراز هات استارت برای سرکوب قطعات غیر اختصاصی که هنگام تکثیر ایجاد می شود، مورد استفاده قرار می گیرد و در نتیجه بازده محصول مورد نظر را بالا می برد. آنزیم Taq استاندارد حتی در دمای 4 درجه و روی یخ نیز می تواند فعال باشد. هنگامی که مواد واکنش با یکدیگر مخلوط می شوند؛ پرایمر ها می توانند به طور غیر اختصاصی به یکدیگر یا به DNA الگو متصل شوند. و آنزیم Taq می تواند اتصالات غیر اختصاصی پرایمرها را همانندسازی کند که نتیجه ی آن تجمع محصولات غیر اختصاصی و کاهش بازدهی خواهد بود.

با هات استارت PCR ، DNA پلیمراز با استفاده از تغییرات شیمیایی یا آنتی بادی غیر فعال می شود؛ و هنگامی که افزایش دما رخ دهد آنتی بادی غیرفعال شده و آنزیم فعال می گردد. در نتیجه به طور چشم گیری اتصال غیر اختصاصی پرایمر و ایجاد پرایمر دایمر کاهش یافته و بازدهی را افزایش می دهد.

نوع تغییر شیمیایی داده شده ی هات استارت نیازمند یک مرحله ی 10 دقیقه ای برای فعال سازی است ونوع  غیرفعال شده با آنتی بادی برای PCR سریع استفاده می شود که کمتر از 2 دقیقه فعال سازی آن زمان می برد.

در مواقعی که مقدار DNA نمونه کم، یا DNA بسیار پیچیده باشد و یا چندین جفت پرایمر استفاده شده باشد (مانند تکنیک multiplex PCR) از هات استارت استفاده می شود. انواع جدیدتر هات استارت نیز فرآیندپذیری ونرخ طویل سازی بالایی دارند اما در عین حال، به خاطر نداشتن قابلیت Proofreading، از این نوع آنزیم نیز به منظور تکثیر قطعه های ژن برای کلون، بیان و تحقیقات جهش زایی نباید استفاده کرد.

3. پلیمرازهای با دقت بالا  High-fidelity polymerases (Hi-Fi)

آنزیم های دارای قابلیت Proofreading (حذف نوکلئوتید های اشتباه) دارای فعالیت اندونکلوئازی از3′ به 5′ هستند، و بازهای اشتباه را در حین طویل سازی رشته ی DNA حذف می کنند. این قابلیت، هنگام طویل سازی رشته DNA ، دقت سنتز را بالا می برد و رشته ی کپی شده ی صحیح تری در اختیار ما قرار می دهد. برای کلونینگ، بیان ژن و مطالعات مربوط به جهش زایی آنزیم های دارای قابلیت Proofreading باید مورد استفاده قرار گیرند.

باید توجه داشت که پلیمرازهای Hi-Fi فعالیت اندونوکلئازی نیز دارند که باز A در انتهای 3′ را برمیدارند؛ پس قطعات تولید شده با این پلیمراز در هنگام کلونینگ را باید با آنزیم های برش دهنده ای که انتهای کور می دهند استفاده کرد. این پلیمرازها از سرعت کمتری برخوردارند، که با افزودن دومین متصل شونده ی high-affinity DNA می توان سرعت تکثیر DNA را افزایش داد. با این کار برای پلیمرازها تکیه گاه ایجاد می شود و از جداشدن زود هنگام جلوگیری می کند؛ البته باید در نظر داشت این پلیمرازها به نسبت گران هستند.

4. پلیمرازهای مخصوص تکثیر قطعه های بزرگ (Polymerases for amplification of long amplicons)

برای تکثیر قطعات بلند، باید خاصیت تکثیر سریع آنزیم های استاندارد را با خاصیت تصحیح نوکلئوتید آنزیم های Proofreading  را ترکیب کرد. این روش با ترکیب پلیمراز مقاوم به دما و آنزیم دارای Proofreading  به دست می آید. با افزودن یک بافر بهینه شده ( معمولا با غلظت نمک بالا) می توان به محصول PCR ی از ژن های بزرگی تا اندازه ی 25 کیلوباز رسید.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

نتیجه گیری

به طور خلاصه می توان گفت که پلیمراز مناسب خود را باید با توجه به این 4 مورد انتخاب کنید:

1. برای کارهای عمومی و روتین از یک پلیمراز معمولی و با تحمل دمای بالا مانند Taq استفاده کنید.
2. برای بیان ژن و ازمایش های مربوط به موتاسیون از انزیم با قدرت تصحیح (proofreading) استفاده کنید.
3. برای رسیدن به قطعه ای دقیق و با بازدهی بالا از پلیمراز هات استارت استفاده کنید.
4. برای قطعات طویل از DNA پلیمرازهای مخصوص قطعات بلند استفاده کنید.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید درباره تکنیک های PCR مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی درباره این آنزیم ها مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.