پروتکل SDS-page

در SDS-page مولکول های باردار زمانی که در محیط الکتریک قرار می گیرند به سمت الکترود با بار مخالف حرکت میکنند. جداسازی مولکول های باردار به تحرک گونه های باردار بستگی دارد. هرچه مولکول ها کوچکتر باشند؛ سریع تر حرکت می کنند. سدیم دودسیل سولفات و پلی آکریلامید اثر ساختار و بار را حذف می کنند در نتیجه پروتئین ها براساس طول زنجیره پلی پپتیدی جدا می شوند.

 

اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.

09101438051

02140443676

کاربرد های SDS-PAGE

از استفاده های SDS-page  میتوان به موارد زیر اشاره کرد:

  • اندازه گیری وزن مولکولی مولکول ها
  • تخمین انداره ی پروتئین
  • پپتید مپینگ
  • مقایسه ی ترکیب بندی پلی پپتید های ساختار های مختلف
  • تخمین خلوص پروتئین
  • وسترن بلات و یوبیکویتیناسیون پروتئین
  • تست HIV برای جداسازی پروتئین های HIV
  • انالیز اندازه و تعداد زیرواحد های پلی پپتید
  • انالیز تغییرات بعد از ترجمه

 

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

خلاصه ی مراحل SDS-page

مواد لازم

منبع انرژی، ژل، نمونه پروتئین، عوامل کاهنده مثل  dithiothreitol یا  2-mercaptoethanol ، بافر ران کننده، رنگ آمیزی با محلول دیستینینگ، نردبان پروتئین.

1) آماده سازی ژل

تمام معرف ها به جز TEMED برای اماده سازی ژل مخلوط می شوند. هنگامی که ژل آماده ی ریختن هست TEMED اضافه می شود. نهایتا ژل در کاست ریخته می شود.

قبل از پلیمریزاسون بوتانول برای حذف حباب ها اضافه می شود. شانه درفضای بین پلیت شیشه گذاشته می شود.

ژل پلیمریزه کننده به عنوان ژل کاست شناخته می شود.

2) آماده سازی نمونه

مقداری اب را به جوش بیارید.

به بافر 2-mercaptoethanol را اضافه نمایید.

محلول بافر را در تیوب میکروفیوژ قرار دهید و نمونه ی پروتئین را به ان اضافه نمایید.

در تیوب های جداگانه مارکر های MW بریزید.

نمونه ها را کمتر از 5 دقیقه بجوشانید تا پروتئین ها کاملا دناتوره شوند.

3) الکتروفورز

ژل کاست از کاست برداشته شود و در کنارمحل قرار گیری الکترود گذاشته می شود.

بافر الکتروفورز 1X در قالب کاست ریخته می شود تا ژل و چاهک ها را بپوشاند.

سپس در تانک گذاشته می شود و به منبع انرژی وصل می شود.

نمونه اجازه دارد در 30mA برای یک ساعت ران شود.

سپس باند ها زیر نور UV قابل مشاهده هستند.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

مراحل انجام کار به تفصیل

آماده سازی ژل پلی آکریلامید

لوازم مورد نیاز

شانه، پلیت های شیشه ای، اسپیسر (سیلیکون تیوب)، گیره کاغذ

شانه برای ایجاد چاهک جهت لود نمونه استفاده می شود. (بر اساس اندازه نمونه خود از شانه مناسب استفاده کنید. برای مثال برای نمونه ای با تعداد 7 عدد و یک مارکر وزن مولکولی از شانه 8 دندانه استفاده کنید.

SDS-page

با دقت پلیت های شیشه ای را با اتانول تمییز کنید و کاست ژل را سرهم کنید.

SDS-page

برای ژل جداکننده، محلول پلی آکریلامید را بریزید. برای جلوگیری از تماس آن با هوا (اکسیژن) تا روی آن اب بریزید چرا که اکسیژن پلیمریزاسیون را محدود می کند. به ژل 20 تا 30 دقیقه زمان بدهید تا ببندد. سپس آب را دور بریزید.

پلیمریزاسیون ژل پلی آکریلامید

پروتئین ها بسته به غلظت ژل جداکننده با سرعت های متفاوتی حرکت می کنند. پس برای پرتیین هدف خود از غلظت مناسب ژل استفاده کنید. هرچه غلظت آکریلامید بیشتر باشد ژلی با منفذ های کوچک تر خواهیم داشت که برای جداسازی پروتئین های کوچک مناسب است. به طور معمول غلظت آکریلامید بین 6 تا 15% استفاده می شود.

SDS-page

ریختن محلول آکریلامید برای ژل جداکننده

محلول آکریلامید را برای انبوه سازی ژل بریزید؛ سپس شانه را قرار دهید و اجازه دهید آکریلامید پلیمریزه شود.

پروتئین ها در ابتدا هنگام عبور از ژل انبوه سازی به ژل جداکننده  بسیار غلیظ هستند. این غلظت به علت تفاوت در سرعت حرکت یون گلایسین، یون کلراید و پروتئین ها می باشد.

SDS-page

اصول انبوه سازی

ریختن محلول آکریلامید برای ژل انبوه ساز

آماده سازی نمونه

به نمونه بافر را اضافه کرده و با تکان دادن تیوب را هم میزنیم.

نمونه ها را در دمای 100 درجه سیلیسیوس به مدت 3 دقیقه گرم می کنیم.

سپس نمونه ها را به مدت 1 دقیقه در دمای 4 درجه با15000 دور سانتریفیوژ می کنیم. همچنین از سوپرناتانت برای SDS-PAGE استفاده می کنیم.

SDS-page

الکتروفورز

گیره های کاغذ، اسپیسر و شانه را برمی داریم و بااستفاده از گیره کاغذ ژل را در دستگاه الکتروفورز قرار می دهیم.

بافر را در بالا و پایین چاهک ریخته و تمام حباب ها و قطعات کوچک ژل را از چاهک ها و زیر ژل با استفاده از سرنگ از بین می بریم.

SDS-page

پلیت ژل روی دستگاه الکتروفورز گذاشته می شود.

نمونه ها و مارکر وزن مولکولی به درون چاهک ها لود می شوند.

منبع انرژی را روشن کرده و ژل را ران کنید تا زمانی که رنگ (BPB) در بافر نمونه به انتهای ژل برسد.

SDS-page

ژل انبوه ساز را از دستگاه الکتروفورز بردارید. ژل را با استفاده از اسپاچول از پلیت شیشه ای جداکنید و برای آنالیز آماده کنید.

SDS-page

SDS-page

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید درباره اصول SDS-page مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی درباره آن مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من