71

روش های استخراج DNA

استخراج DNA

سال های سال است که محققان از روش های مختلفی برای استخراج DNA استفاده می کنند. این روش ها سال به سال بهتر و کاربردی تر می شوند. اگر به طور کلی بخواهیم به استخراج ژنوم بپردازیم می توانیم آن را به سه مرحله اساسی تقسیم کنیم:

  1. مرحله لیز سلولی

    در این مرحله دیواره یا غشای سلول را می شکنیم و محتویات درون سلولی درون میکروتیوب آزمایش آزاد و رها می شوند.

  2. جداسازی DNA از آلودگی ها

    در اینجا هر ملکول دیگری غیر از DNA عامل مزاحم و آلودگی محسوب می شود و باید حذف گردد. معمولا در این مرحله دو فاز ایجاد می شود؛ به صورتی که DNA در یک فاز و عوامل آلوده کننده در فاز دیگر قرار می گیرند.

  3. بازیابی DNA

    در این مرحله DNA محلول را تغلیظ و خالص سازی می کنیم.

اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.

09101438051

02140443676

روش های مختلف استخراج

روش فنل-کلروفورم

یکی از قدیمی ترین روش ها است و از دهه 60 میلادی تا کنون در خیلی از آزمایشگاه ها به علت ارزانی و در دسترس بودن استفاده می شود:

  1. مرحله لیز سلولی

    سلول ها از نظر دیواره به دو دسته تقسیم می شوند؛ دسته اول سلول هایی هستند که دارای دیواره هستند، مثل باکتری های گرم مثبت، قارچ ها و گیاهان. دسته دوم بدون دیواره می باشند؛ مانند باکتری های گرم منفی، سلول های خون و بافت. اگر سلول دارای دیواره باشد باید با روش هایی این دیواره شکسته شود.
    به طور کلی دو روش برای شکستن دیواره مورد استفاده قرار می گیرد؛ روش های آنزیمی و روش های مکانیکی.
    مثل استفاده از آنزیم هایی مثل سلولاز یا کیتیناز؛ و یا شکستن دیواره سلول با استفاده از نیتروژن مایع و هاون چینی. اگر سلول مورد نظر شما جز دسته دوم بود نیاز به انجام این مرحله نیست.
    هر آزمایشگاهی با توجه به موجودی مواد و ترجیحات خاص ممکن است از مواد خاصی برای لیز سلول ها استفاده کند اما معمول ترین مواد مورد استفاده در آزمایشگاه ها برای لیز سلولی عبارتند از Tris-HCl، EDTA، SDS، NaCL و MgC .

    Tris-HCl یک اسید و باز مزدوج است که می تواند pH محلول را بین 7 تا 9 نگه دارد. EDTA مخفف اتیلن دی آمین- تترا استیک اسید می باشد. این ماده یون های دو ظرفیتی را از محلول حذف می کند؛ وقتی سلول لیز می شود تمام مواد داخل سلولی به محلول واکنش وارد می شود. یکی از این مواد آنزیم DNase  می باشد. این آنزیم برای عملکرد خود نیازمند یون  بوده و EDTA با حذف این ماده جلوی تخریب ژنوم را توسط این آنزیم می گیرد.
    SDS یک دترجنت است؛ دترجنت ها چربی ها را در آب محلول می کنند. همانطور که میدانید غشای سلولی هم از نوع لیپید بوده و SDS باعث ناپایداری و از بین رفتن غشای سلول می شود. NaCL در بافر جلوی دناتوره شده DNA را می گیرد. MgC  نیز جلوی اینتراکشن DNA با سایر ارگانل های سلولی را می گیرد.

  1. حذف آلودگی ها از DNA

    در این مرحله فنول کلروفورم-ایزوآمیل الکل افزوده می شود. و محلول را با ورتکس، پیپتاژ کردن یا برعکس کردن(Inverting) میکروتیوب مخلوط می کنیم. هر کدام از این روش های مخلوط کردن یک تنش در محلول ایجاد می کنند. هرچه ای تنش شدیدتر باشد، (مثل ورتکس کردن) احتمال آسیب رسیدن به DNA بیشتر است. پس اگر نمونه مورد نظر شما دارای DNA کوچکی بود یا برای کارهایی مثل توالی یابی بهتر است روش های آرام تر مثل Invert کردن را امتحان کنید.
    پس از این مرحله یک مرحله سانتریفیوژ انجام می دهیم و سه فاز خواهیم داشت. رسوب زیرین که شامل فنل- که یک ماده غیرقطبی است- می شود و تمامی مواد غیرقطبی مثل لیپید و RNA نیز در این فاز قرار میگیرند. قسمت میانی را کلروفورم تشکیل می دهد که پروتئین های سلولی را در خود دارد. اما فاز محلول یا رویی این میکروتیوب فاز قطبی است که دارای ژنوم می باشد. ما این محلول رویی را جدا کرده و به تیوب جدید منتقل می کنیم.
    نمونه ای از این رسوب در شکل 1 نشان داده شده است.

شکل 1- نمونه ای از استخراج ژنوم با فنل-کلروفورم. سه فاز توضیح داده شده در بالا در شکل نشان داده شده است.

  1. بازیابی DNA

    در این مرحله ما باید DNA را رسوب دهیم. زیرا اولا می خواهیم بدانیم که DNA داریم یا نه، دوما میخواهیم آن را شست و شو دهیم سوما آن را غلیظ کنیم. در این مرحله از سدیم استات و اتانول استفاده می کنیم؛ سدیم استات با فسفات های DNA پیوند یونی و اتانول با آب پیوند هیدروژنی ایجاد می کند. در نتیجه DNA قابلیت حلالیت در آب را از دست میدهد و رسوب میکند. پس از آن با سانترفیوژ DNA را رسوب می دهیم. سپس رسوب را از اتانول پاک کرده و درون بافر تریس-EDTA نگه داری میکنیم.
    با وجود سادگی روش فنل کلروفورم، این روش یک عیب بزرگ دارد. فنل به شدت سمی و خورنده است. در تماس با پوست به شدت پوست را می سوزاند. به همین خاطر دانشمندان روش های ایمن تری را جایگزین این روش کرده اند. مثل روش salting out.

کیت های استخراج شرکت پویاژن آزما با روش غیر سمی salting out می باشد، و برای کار با کیت های شرکت ما نیاز به ستون هم ندارید.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

روش Salting out

از بین انواع روش های استخراج ژنوم، روش سالتینگ اوت بسیار برای کار مناسب است؛ هم خطرات و سمی بودن روش هایی مثل فنل کلروفورم را ندارد، نیاز به مواد خیلی خاص و پیچیده ای نبوده و حتی بدون نیاز به ستون انجام می شود.

به طور کلی برای استخراج ژنوم سه مرحله اساسی باید انجام بشه:

  1. مرحله لیز سلولی

    در این مرحله باید دیواره و غشا سلول را از بین ببریم. غشای سلول معمولا با کمک تریس، EDTA و بعضی محلول های نمکی شکسته می شود.

  2. حذف آلودگی از DNA

    آلودگی در اینجا یعنی هر چیزی غیر از DNA! پس اینجا تمام اجزای سلولی به جز خود ژنوم مزاحم کار ما هستند و باید حذف شوند. در روش سالتینگ اوت با کمک غلظت بالای نمک و سانتریفیوژ این جداسازی به راحتی انجام می شود. DNA تو فاز محلول مانده و بقیه اجزا سلولی رسوب می کنند و از هم جدا می شوند.

  3. خالص سازی DNA

    حالا که از شر آلودگی ها راحت شدیم باید ژنوم را رسوب بدهیم و تغلیظش کنیم. در این مرحله اتانول مطلق به ما کمک می کند. البته به یاد داشته باشید که بعد سانتریفیوژ حتما حتما میکروتیوب را در دمای اتاق بگذارید تا الکل کاملا تبخیر شود.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده باشد.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من