RFLP-PCR

تکنیک RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction) یکی از روش های مهم در زیست شناسی مولکولی است که برای شناسایی تفاوت های ژنتیکی در توالی های DNA استفاده میشود. این تکنیک ترکیبی از دو روش RFLP و PCR است که هر کدام نقش خاصی در فرآیند دارند.

تعریف RFLP

RFLP به معنای پلی مورفیسم طول قطعات محدود شده است. در این روش، DNA با استفاده از آنزیم های محدودکننده به قطعات کوچکتر تقسیم میشود. این آنزیم ها توالی های خاصی از DNA را شناسایی کرده و در آن نقاط برش می دهند. سپس قطعات تولید شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم جدا می شوند و الگوهای متفاوتی از قطعات DNA به دست می آید که می توانند برای شناسایی تفاوت های ژنتیکی استفاده شوند.

تعریف PCR 

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز، روشی است که برای تکثیر یک بخش خاص از DNA استفاده میشود. این روش به محققان اجازه می دهد تا از مقدار کمی DNA، تعداد زیادی نسخه از آن بخش خاص تولید کنند. PCR شامل سه مرحله اصلی است:

دناتوراسیون (جدا شدن دو رشته DNA)

دناتوراسیون (Denaturation) یکی از مراحل کلیدی در فرآیند PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز) است. در این مرحله، DNA دو رشته ای به دو رشته تک رشته ای تبدیل میشود. این کار با افزایش دما به حدود 94-98 درجه سانتیگراد به مدت 20-30 ثانیه انجام می شود.

در این دما، پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل DNA شکسته می شوند و دو رشته DNA از هم جدا می شوند. این مرحله برای فراهم کردن دسترسی آنزیم DNA پلیمراز به رشته های تکرشته ای ضروری است تا بتواند رشته های جدید DNA را سنتز کند.

هیبریداسیون/ اتصال پرایمرها به رشته های تک تک شده

اتصال پرایمر به رشته های تک رشته ای DNA یکی از مراحل مهم در فرآیند PCR است. این مرحله به عنوان هیبریداسیون یا اتصال پرایمر شناخته می شود. در این مرحله، دمای واکنش به حدود 50-65 درجه سانتیگراد کاهش می یابد تا پرایمرها بتوانند به توالی های مکمل خود در رشته های تک رشته ای DNA متصل شوند.

پرایمرها توالی های کوتاه DNA هستند که به طور خاص طراحی شده اند تا به نواحی خاصی از DNA هدف متصل شوند. این اتصال به آنزیم DNA پلیمراز اجازه می دهد تا از پرایمر به عنوان نقطه شروع برای سنتز رشته جدید DNA استفاده کند.

تمدید (تکثیر) DNA با استفاده از آنزیم پلیمراز

مرحله تمدید (تکثیر) در PCR به عنوان طولانی سازی یا تمدید شناخته میشود. در این مرحله، آنزیم DNA پلیمراز نقش اصلی را ایفا میکند. این مرحله به طور معمول در دمای حدود 72 درجه سانتیگراد انجام میشود، که دمای بهینه برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز است.

در این مرحله، آنزیم DNA پلیمراز به پرایمرهای متصل شده به رشته های تک رشته ای DNA متصل می شود و شروع به افزودن نوکلئوتیدهای مکمل به انتهای 3′ پرایمرها می کند. این فرآیند باعث سنتز رشته جدید DNA می شود که مکمل رشته الگو است.

این مرحله به طور معمول حدود 30-60 ثانیه طول می کشد، بسته به طول قطعه DNA که باید تکثیر شود. در پایان این مرحله، یک چرخه PCR کامل میشود و تعداد کپی های DNA هدف دو برابر می شود.

RFLP-PCR

ترکیب RFLP و PCR

در تکنیک RFLP-PCR، ابتدا بخش خاصی از DNA با استفاده از PCR تکثیر می شود. سپس این بخش تکثیر شده با استفاده از آنزیم های محدودکننده به قطعات کوچکتر تقسیم می شود. این قطعات با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم جدا می شوند و الگوهای متفاوتی از قطعات DNA به دست می آید که می توانند برای شناسایی تفاوت های ژنتیکی استفاده شوند.

مراحل انجام RFLP-PCR

1.استخراج DNA:

ابتدا DNA از نمونه های زیستی استخراج میشود.

2.تکثیر DNA با PCR:

بخش خاصی از DNA با استفاده از PCR تکثیر می شود.

3.هضم DNA با آنزیمهای محدودکننده:

DNA تکثیر شده با استفاده از آنزیم های محدودکننده به قطعات کوچکتر تقسیم میشود.

4.الکتروفورز ژل آگارز:

قطعات DNA تولید شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از هم جدا می شوند.

5. تجزیه و تحلیل الگوهای قطعات:

الگوهای متفاوتی از قطعات DNA به دست می آید که می توانند برای شناسایی تفاوت های ژنتیکی استفاده شوند.

RFLP-PCR

کاربردهای RFLP-PCR

• نقشه کشی ژنومی: شناسایی مکان های ژنی در ژنوم.

• تشخیص بیماری های ژنتیکی: شناسایی جهش های ژنتیکی مرتبط با بیماری ها.

• تعیین پدری: استفاده در آزمایش های تعیین پدری.

• شناسایی گونه ها: شناسایی تفاوت های ژنتیکی بین گونه های مختلف.

• مطالعات تکاملی: بررسی تفاوت های ژنتیکی در جمعیت های مختلف برای مطالعات تکاملی.

مزایا و معایب RFLP-PCR

مزایا:

• دقت بالا در شناسایی تفاوت های ژنتیکی.

• قابلیت استفاده در نمونه های مختلف زیستی.

• امکان شناسایی جهش های تکنوکلئوتیدی (SNP).

معایب:

• نیاز به تجهیزات پیشرفته و تخصصی.

• زمانبر بودن فرآیند.

• هزینه های بالا برای انجام آزمایش ها.

نتیجه گیری

تکنیک RFLP-PCR یکی از روش های قدرتمند در زیست شناسی مولکولی است که برای شناسایی تفاوت های ژنتیکی در توالی های DNA استفاده می شود. این تکنیک با ترکیب دو روش RFLP و PCR، دقت و کارایی بالایی در شناسایی تفاوت های ژنتیکی دارد و در کاربردهای مختلفی از جمله نقشه کشی ژنومی، تشخیص بیماری های ژنتیکی، تعیین پدری و شناسایی گونه ها مورد استفاده قرار میگیرد.

شرکت پویا ژن آزما با استفاده از تجربه و تخصص در حوزه­ تحقیق و تولید فراورده ­های بیوتکنولوژی موفق به تولید انواع سیستم های تصفیه فاضلاب های صنعتی بر اساس بیوفیلتر شده است که قادر است این فاضلاب ها را تا میزان استانداردهای سازمان حفاظت محیط زیست تصفیه کرده و آب حاصل مجددا مورد استفاده قرار گیرد.