با یک مقاله دیگر در پویاژن در مورد روش الکتروفورز در خدمت شما هستیم.

الکتروفورز، روشی برای جداسازی و شناسایی مولکول‌ها از طریق اعمال جریان الکتریکی است. این روش برای جداسازی مولکول‌های باردار مانندRNA ، DNA و پروتئین در آزمایشگاه‌های مولکولی و بیوشیمی کاربرد دارد. به منظور جداسازی DNA از ژل آگارز، برای جداسازی RNA از ژل PAGE و برای جداسازی پروتئین از ژل SDS-PAGE استفاده می کنیم. برای یادگیری روش تهیه ژل آگارز و نحوه استفاده از آن برای بررسی انواع نمونه DNA این مقاله را مطالعه کنید.

آگارز چیست؟

آگارز معمولا به صورت پودرهای آماده به فروش می رسد و در ترکیب با بافر TAE یا TBE  تبدیل به ماتریکس سه بعدی متخلخلی می شود. در واقع ملکول های DNA از بین این تخلخل ها و حفرات عبور می کنند؛ در نتیجه هر چه ژل درصد پایین تری داشته باشد حفرات بزرگتر خواهند بود و حرکت ملکول های DNA سریع تر. و برعکس هرچه درصد ژل بالاتر باشد حفرات کوچک تر خواهند شد و عبور از میان این تخلخل ها برای DNA سخت تر خواهد بود.

چه چیزی DNA را به حرکت در می آورد؟

همانطور که می دانید ملکول های DNA دارای بار منفی هستند، در نتیجه با قرار دادن ژل آگارز در معرض جریان الکتریکی می توان ملکول های DNA را از نظر اندازه جدا کرد.در واقع ملکول های DNA به سمت قطب مخالف یعنی کاتد حرکت می کنند. همانطور که در بالا اشاره شد به خاطر وجود حفرات و تخلخل در ژل، هر چه ملکول DNA بزرگتر باشد، حرکت سخت تر و کندتر خواهد بود. در نتیجه ملکول های کوچک سریع تر حرکت کرده و به این ترتیب ملکول ها از نظر اندازه از هم جدا می شوند.

تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز

برای تهیه ژل ابتدا پودر ژل به کمک حرارت در بافرهای مخصوص محلول می شود. مقدار معینی از پودر ژل (براساس غلظت ژل که معمولا برای بررسی DNA از ژل یک درصد استفاده میشود) وزن شده و با مقدار معینی از بافر (می‌تواند بافر TAE یا TBE باشد) مخلوط می‌شود.

پس از حل شدن کامل پودر آگارز روی حرارت، درون قالب ژل ریخته می‌شود. قالب را با توجه به فیلم و تصاویر آماده کنید. شانه مناسب با نوع نمونه جهت ایچاد چاهک روی قالب سوار میشود تا پس از خنک شدن، ژل بسته شده و شکل گیرد.

 

آماده سازی نمونه

پس از بستن ژل، نمونه خود را با loading dye مخلوط کرده (معمولا برای هر 10 میکرولیتر نمونه یک تا دو میکرولیتر از لودینگ دای کافیست) و درون چاهک ها لود کنید. برای این کار میتوانید از loading dye شماره 4 پویاژن آزما استفاده کنید که برای مشاهده بهتر روی ژل اپتیمایز شده است. لودینگ دای دو کاربرد دارد: به علت دارا بودن گلیسرول باعث سنگین شدن نمونه و نشستن آن به انتهای چاهک می شود و با رنگی کردن آن در دنبال کردن DNA روی ژل به صورت تقریبی به ما کمک می کند.

نکته: حتما در کنار نمونه هایی که لود میکنید مارکر (لدر) هم در یک چاهک از ژل اضافه کنید. مارکر حاوی اندازه های مختلف از DNA است که با استفاده از راهنما مشخص میکند هریک از باندهای ایجاد شده چه اندازه ای دارد و شما میتوانید اندازه باند DNA خودتان را مشخص کنید.

ران الکتروفورز

ژل تهیه شده در محفظه‌ای به نام تانک الکتروفورز قرار می‌گیرد. این تانک با بافری که عبور جریان از ژل را تسهیل می‌کند پر شده است . (از همان بافری که برای تهیه ژل استفاده کرده اید درون تانک بریزید).

تانک توسط دو الکترود به یک منبع الکتریکی برای اعمال جریان الکتریکی متصل می‌شود. جهت قرارگیری الکترود طوری است که مولکول‌ها بتوانند به سمت الکترود مخالف حرکت کنند.

الکتروفورز  و رنگ آمیزی ژل آگارز

برای رنگ آمیزی ژل آگارز دو روش وجود دارد:

1. هنگامی که ژل آگارز حل شده و تا حدی که دست را نسوزاند سرد شد (دمای 37درجه سانتی گراد)، حدود g/ml2µ/0 تا 5/0 اتیدیوم برماید به آن اضافه کنید (معمولا 2-3 میکرولیتر از استوک آزمایشگاهی برای 100 میلی لیتر ژل) و سپس آن را درون تانک الکتروفورز قرار دهید. (اما باید توجه داشته باشید، تانک الکتروفورز و تمامی وسایل آن باید جدا باشند تا اتیدیوم برماید بخش های دیگر را آلوده نکند، زیرا اتیدیوم برماید یک ماده سرطان زا بوده، با دستکش و وسایل مختص بخش الکتروفورز با آن کار کنید و محض تماس با پوستتان آن را با آب فراوان بشویید.)
2. روش دیگر این است که پس از پایان الکتروفورز، ژل را درون ظرفی حاوی میزان زیاد محلول اتیدیوم برماید قرار دهید تا ژل رنگ شود. اما این روش به دلیل احتمال بیشتر آلودگی توضیه نمیشود.

ارتباط بین ولتاژ، جریان و نقش بافر در فرآیند الکتروفورز DNA:

در فرآیند الکتروفورز DNA، دستگاه منبع تغذیه الکتریکی (پاور ساپلای) دو پارامتر کلیدی، یعنی ولتاژ (ولت) و جریان الکتریکی (میلی‌آمپر) را کنترل می‌کند. این دو عامل نقش مهمی در تعیین سرعت مهاجرت مولکول‌های DNA در ژل دارند. بنابراین شناخت ارتباط این دو مورد برای بهینه‌سازی شرایط الکتروفورز ضروری است. ولتاژ، نیروی محرکه‌ای است که باعث حرکت DNA  در میدان الکتریکی می‌شود، در حالی که جریان نشان‌دهنده میزان الکتریسیته عبوری از سیستم است. این دو با قانون اهم (V = I × R) به یکدیگر مرتبط هستند و تغییر در یکی، بسته به مقاومت مدار، می‌تواند بر دیگری تأثیر بگذارد. اگر ولتاژ ثابت باشد و جریان تغییر کند:

در طول زمان، با گرم شدن سیستم مقاومت کم می‌شود، بنابراین طبق قانون اهم:

با ثابت ماندن ولتاژ، جریان به ‌مرور افزایش می یابد و در نتیجه ممکن است باعث گرمایش زیاد ژل و پخش شدن باندها شود. حالت ولتاژ ثابت برای جداسازی دقیق‌تر قطعات DNA استفاده می‌شود.

اگر جریان(mA) ثابت باشد و ولتاژ تغییر کند:

در این حالت ولتاژ تغییر می‌کند تا جریان ثابت بماند و طبق قانون اهم:

 

به عبارتی هرچه ژل گرم‌تر و مقاوم‌تر شود، دستگاه ولتاژ را کم می‌کند تا جریان در سطح مورد نظر باقی بماند.

در این حالت چون ولتاژ دائماً تغییر می‌کند، مهاجرت DNA ممکن است غیر یکنواخت باشد و دقت تفکیک کم‌تر شود.

چرا از بافر در الکتروفورز استفاده می‌شود؟

در الکتروفورز ، بافر چند کار اساسی انجام می‌دهد:

1. رسانای جریان الکتریکی بین الکترودها می باشد.
2.  pH محیط را ثابت نگه می‌دارد چراکه  DNA در pH پایین تخریب و در pH بالا دناتوره می‌شود.
3. از گرم شدن بیش از حد جلوگیری می‌کند.
4. حاوی یون‌های خاصی است که مهاجرت DNA را هدایت می‌کنند.

همانطور که قبلا نیز اشاره شد در این روش عموما از دو بافر TBE و TAE استفاده می شود. اما چه موقع باید از TAE استفاده کرد؟

• وقتی که بخواهیم بعد از الکتروفورز ژل را ببریم و DNA را از ژل استخراج کنیم
• برای قطعات DNA بلند (>1kb).
• در آزمایش‌هایی که ممکن است چند ساعت طول بکشد چون در ولتاژ بالا کمتر داغ می‌شود.

بافر TAE خیلی سریع خاصیت بافری‌ خود را از دست می‌دهد و این یکی از نقاط ضعف این بافر است.

چه زمانی از بافر TBE استفاده می کنیم؟

• هنگامیکه به وضوح بالا و تفکیک دقیق باندها نیاز داشته باشیم
• هنگامیکه ‌بخواهیم ژل سریع‌تر آماده شود (چون رسانایی بالاتری داره).
• مناسب برای قطعات کوچک DNA

در هنگام استفاده از بافر TBE باید دقت کرد، زیرا در ولتاژهای بالا ممکن است ژل بیش از حد گرم شود و در نتیجه، باندهای DNA پخش یا مبهم شوند.

مقایسه‌ی دو بافر رایج TAE و TBE:

 

 

مشاهده ی باندهای DNA

پس از اتمام حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی را قطع کرده و ژل توسط دستگاه ژل داک که از نور UV برای آشکار سازی رنگ‌های فلورسنت استفاده می‌کند، تصویر برداری ‌شود.

نکته: می توانید از نوعی رنگ امن تر به نام safe stain استفاده کنید. اما بدانید این رنگ نیز سمی است و کاملا امن نیست (هر ماده ای که به DNA متصل میشود امن نیست).

 

الکتروفورز ژل با میدان پالسی (Pulse Field Gel Electrophoresis) چیست؟

الکتروفورز ژل با میدان پالسی یا به صورت خلاصه PFGE، تکنیکی برای جداسازی مولکول‌های DNA بسیار بزرگ است.

در شرایط معمول الکتروفورز، میدان الکتریکی در یک جهت بر روی ژل آگارز اعمال می‌شود و مولکول‌های DNA بزرگ‌تر از ۴۰ کیلوباز تقریباً با هم و بدون توجه به اندازه‌شان از درون ژل حرکت می‌کنند.

در مقابل، PFGE میدان الکتریکی را به‌صورت تناوبی در جهات مختلف تغییر می‌دهد. با وارد کردن یک شیب ولتاژ متناوب در سیستم PFGE، قطعات خیلی بزرگ DNA می‌توانند با سرعت‌های متفاوتی از طریق تغییر جهت و حرکت در ژل از هم جدا شوند.
عموما قطعات بزرگ‌DNA،به شکل آهسته تری خود را با تغییر جهت میدان تنظیم می‌کنند، در حالی‌که قطعات کوچکتر سریع‌تر واکنش نشان می‌دهند، که این موضوع باعث جداسازی بهتر آن‌ها می‌شود.

 

تجهیزات و شرایط لازم برای اجرای موفق PFGE

بیایید نگاهی دقیق‌تر به تجهیزات و شرایط مورد نیاز برای یک PFGE موفق بیندازیم:

• یک محفظه‌ی الکتروفورز که حاوی بافر (محلول رسانا) می باشد.
• ژل آگارز می بایست به‌خوبی در مرکز این محفظه محکم شده باشد تا حرکت نکند.
• اطراف ژل چند جفت الکترود به شکل شبکه‌ی شش‌ضلعی (هگزاگونال) قرار می گیرد.
• این آرایش شش‌ضلعی باعث می‌شود بتوان میدان الکتریکی را به‌صورت دوره‌ای بین سه جهت مختلف تغییر داد:
  • یکی از مرکز ژل عبور می‌کند
  • دو جهت دیگر با زاویه‌ی ۶۰ درجه در طرفین آن قرار دارند.

 

 

 

ویژگی‌های فنی PFGE

• PFGE  به دلیل اندازه‌ی بزرگ قطعات DNA و حرکت غیرخطی آن‌ها، زمان بیشتری نسبت به الکتروفورز معمولی نیاز دارد.
• برای جلوگیری از گرم شدن بیش از حد ژل (که باعث کاهش وضوح باندها می‌شود)، یک ماژول خنک‌کننده دمای بافر را کنترل می‌کند. دمای معمول در برنامه‌های PFGE حدود ۱۴ تا ۱۵ درجه سانتی‌گراد است.
• بسیار مهم است که هیچ هوایی در لوله‌های ورودی و خروجی سیستم خنک‌کننده وجود نداشته باشد.

 

کاتالوگ بیوفیلتر 1403

برای رفتن به تصفیه فاضلاب صنعتی  از این لینک استفاده کنید.