با یک مقاله دیگر در پویاژن در مورد روش الکتروفورز در خدمت شما هستیم.
الکتروفورز، روشی برای جداسازی و شناسایی مولکول‌ها از طریق اعمال جریان الکتریکی است. این روش برای جداسازی مولکول‌های باردار مانندRNA ، DNA و پروتئین در آزمایشگاه‌های مولکولی و بیوشیمی کاربرد دارد. به منظور جداسازی DNA از ژل آگارز، برای جداسازی RNA از ژل PAGE و برای جداسازی پروتئین از ژل SDS-PAGE استفاده می کنیم. برای یادگیری روش تهیه ژل آگارز و نحوه استفاده از آن برای بررسی انواع نمونه DNA این مقاله را مطالعه کنید.
آگارز چیست؟
آگارز معمولا به صورت پودرهای آماده به فروش می رسد و در ترکیب با بافر TAE یا TBE تبدیل به ماتریکس سه بعدی متخلخلی می شود. در واقع ملکول های DNA از بین این تخلخل ها و حفرات عبور می کنند؛ در نتیجه هر چه ژل درصد پایین تری داشته باشد حفرات بزرگتر خواهند بود و حرکت ملکول های DNA سریع تر. و برعکس هرچه درصد ژل بالاتر باشد حفرات کوچک تر خواهند شد و عبور از میان این تخلخل ها برای DNA سخت تر خواهد بود.
چه چیزی DNA را به حرکت در می آورد؟
همانطور که می دانید ملکول های DNA دارای بار منفی هستند، در نتیجه با قرار دادن ژل آگارز در معرض جریان الکتریکی می توان ملکول های DNA را از نظر اندازه جدا کرد.در واقع ملکول های DNA به سمت قطب مخالف یعنی کاتد حرکت می کنند. همانطور که در بالا اشاره شد به خاطر وجود حفرات و تخلخل در ژل، هر چه ملکول DNA بزرگتر باشد، حرکت سخت تر و کندتر خواهد بود. در نتیجه ملکول های کوچک سریع تر حرکت کرده و به این ترتیب ملکول ها از نظر اندازه از هم جدا می شوند.
تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز
برای تهیه ژل ابتدا پودر ژل به کمک حرارت در بافرهای مخصوص محلول می شود. مقدار معینی از پودر ژل (براساس غلظت ژل که معمولا برای بررسی DNA از ژل یک درصد استفاده میشود) وزن شده و با مقدار معینی از بافر (می‌تواند بافر TAE یا TBE باشد) مخلوط میشود.
پس از حل شدن کامل پودر آگارز روی حرارت، درون قالب ژل ریخته میشود. قالب را با توجه به فیلم و تصاویر آماده کنید. شانه مناسب با نوع نمونه جهت ایچاد چاهک روی قالب سوار میشود تا پس از خنک شدن، ژل بسته شده و شکل گیرد.
تصویری از مراحل تهیه ژل آگارز در الکتروفورز. دقت کنید که باید بالا و پایین قالب بسته باشد (باچسب) و پس از بستن ژل چسب ها را جدا کرده و ژل را درون تانک قرار دهید.
آماده سازی نمونه
پس از بستن ژل، نمونه خود را با loading dye مخلوط کرده (معمولا برای هر 10 میکرولیتر نمونه یک تا دو میکرولیتر از لودینگ دای کافیست) و درون چاهک ها لود کنید. برای این کار میتوانید از loading dye شماره 4 پویاژن آزما استفاده کنید که برای مشاهده بهتر روی ژل اپتیمایز شده است. لودینگ دای دو کاربرد دارد: به علت دارا بودن گلیسرول باعث سنگین شدن نمونه و نشستن آن به انتهای چاهک می شود و با رنگی کردن آن در دنبال کردن DNA روی ژل به صورت تقریبی به ما کمک می کند.
به این صورت نمونه را به درون ژل لود کنید
تصویری از لود نمونه درون ژل الکتروفورز
نکته: حتما در کنار نمونه هایی که لود میکنید مارکر (لدر) هم در یک چاهک از ژل اضافه کنید. مارکر حاوی اندازه های مختلف از DNA است که با استفاده از راهنما مشخص میکند هریک از باندهای ایجاد شده چه اندازه ای دارد و شما میتوانید اندازه باند DNA خودتان را مشخص کنید.
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
ران الکتروفورز
ژل تهیه شده در محفظه‌ای به نام تانک الکتروفورز قرار می‌گیرد. این تانک با بافری که عبور جریان از ژل را تسهیل میکند پر شده است . (از همان بافری که برای تهیه ژل استفاده کرده اید درون تانک بریزید).
تانک توسط دو الکترود به یک منبع الکتریکی برای اعمال جریان الکتریکی متصل میشود. جهت قرارگیری الکترود طوری است که مولکول‌ها بتوانند به سمت الکترود مخالف حرکت کنند.
تصویری از حرکت نمونه ها درون ژل آگارز با دور تند
تصویری از انجام الکتروفورز درون تانک الکتروفورز. مولکولهایی که کوچکتر هستند سریعتر حرکت کرده و در پایین ژل قرار میگیرند
الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل آگارز
برای رنگ آمیزی ژل آگارز دو روش وجود دارد:
- هنگامی که ژل آگارز حل شده و تا حدی که دست را نسوزاند سرد شد (دمای 37درجه سانتی گراد)، حدود g/ml2µ/0 تا 5/0 اتیدیوم برماید به آن اضافه کنید (معمولا 2-3 میکرولیتر از استوک آزمایشگاهی برای 100 میلی لیتر ژل) و سپس آن را درون تانک الکتروفورز قرار دهید. (اما باید توجه داشته باشید، تانک الکتروفورز و تمامی وسایل آن باید جدا باشند تا اتیدیوم برماید بخش های دیگر را آلوده نکند، زیرا اتیدیوم برماید یک ماده سرطان زا بوده، با دستکش و وسایل مختص بخش الکتروفورز با آن کار کنید و محض تماس با پوستتان آن را با آب فراوان بشویید.)
- روش دیگر این است که پس از پایان الکتروفورز، ژل را درون ظرفی حاوی میزان زیاد محلول اتیدیوم برماید قرار دهید تا ژل رنگ شود. اما این روش به دلیل احتمال بیشتر آلودگی توضیه نمیشود.
مشاهده ی باندهای DNA
پس از اتمام حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی را قطع کرده و ژل توسط دستگاه ژل داک که از نور UV برای آشکار سازی رنگ‌های فلورسنت استفاده میکند، تصویر برداری شود.
الکترووفورز
نکته: می توانید از نوعی رنگ امن تر به نام safe stain استفاده کنید. اما بدانید این رنگ نیز سمی است و کاملا امن نیست (هر ماده ای که به DNA متصل میشود امن نیست).
برای رفتن به تصفیه فاضلاب صنعتی از این لینک استفاده کنید.
