با یک مقاله دیگر در پویاژن در مورد روش الکترووفورز در خدمت شما هستیم.
الکتروفورز، روشی برای جداسازی و شناسایی مولکول‌ها از طریق اعمال جریان الکتریکی است. این روش برای جداسازی مولکولهای باردار مانندRNA ، DNA و پروتئین در آزمایشگاه‌های مولکولی و بیوشیمی کاربرد دارد. برای یادگیری روش تهیه ژل آگارز و نحوه استفاده از آن برای بررسی انواع نمونه DNA این مقاله را مطالعه کنید.
https://www.aparat.com/v/FoU8f
الکترووفورز چیست؟
ژل متخلخل مورد استفاده در این تکنیک از آگارز یا پلی‌آکریلامید ساخته میشود. با کاهش و افزایش غلظت ژل‌های مورد استفاده در الکتروفورز می‌توان منافذ این ژل را برای جداسازی مولکولهای کوچکتر مناسب کرد. برای مولکولهای اسیدنوکلئیک از آگارز استفاده میکنیم.
پس از تهیه ژل آن را در طوری در معرض جریان الکتریسیته قرار میدهیم .با این کار مولکولهای اسیدنوکلئیک که بار منفی دارند، به سمت قطب مثبت جریان حرکت کنند.
تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز
برای تهیه ژل ابتدا پودر ژل به کمک حرارت در بافرهای مخصوص محلول می شود. مقدار معینی از پودر ژل (براساس غلظت ژل که معمولا برای بررسی DNA از ژل یک درصد استفاده میشود) وزن شده و با مقدار معینی از بافر (می‌تواند بافر TAE یا TBE باشد) مخلوط میشود.
پس از حل شدن کامل پودر آگارز روی حرارت، درون قالب ژل ریخته میشود. قالب را با توجه به فیلم و تصاویر آماده کنید. شانه مناسب با نوع نمونه جهت ایچاد چاهک روی قالب سوار میشود تا پس از خنک شدن، ژل بسته شده و شکل گیرد.
برای خرید کیت استخراج دلخواه خود از این لینک استفاده کنید.
تصویری از مراحل تهیه ژل آگارز در الکتروفورز. دقت کنید که باید بالا و پایین قالب بسته باشد (باچسب) و پس از بستن ژل چسب ها را جدا کرده و ژل را درون تانک قرار دهید.
آماده سازی نمونه
پس از بستن ژل، نمونه خود را با loading dye مخلوط کرده (معمولا برای هر 10 میکرولیتر نمونه یک تا دو میکرولیتر از لودینگ دای کافیست) و درون چاهک ها لود کنید. برای این کار میتوانید از loading dye شماره 4 پویاژن آزما استفاده کنید که برای مشاهده بهتر روی ژل اپتیمایز شده است.
به این صورت نمونه را به درون ژل لود کنید
تصویری از لود نمونه درون ژل الکتروفورز
نکته: حتما در کنار نمونه هایی که لود میکنید مارکر (لدر) هم در یک چاهک از ژل اضافه کنید. مارکر حاوی اندازه های مختلف از DNA است که با استفاده از راهنما مشخص میکند هریک از باندهای ایجاد شده چه اندازه ای دارد و شما میتوانید اندازه باند DNA خودتان را مشخص کنید.
الکترووفورز
ژل تهیه شده در محفظه‌ای به نام تانک الکتروفورز قرار می‌گیرد. این تانک با بافری که عبور جریان از ژل را تسهیل میکند پر شده است . (از همان بافری که برای تهیه ژل استفاده کرده اید درون تانک بریزید).
تانک توسط دو الکترود به یک منبع الکتریکی برای اعمال جریان الکتریکی متصل میشود. جهت قرارگیری الکترود طوری است که مولکول‌ها بتوانند به سمت الکترود مخالف حرکت کنند.
تصویری از حرکت نمونه ها درون ژل آگارز با دور تند
تصویری از انجام الکتروفورز درون تانک الکتروفورز. مولکولهایی که کوچکتر هستند سریعتر حرکت کرده و در پایین ژل قرار میگیرند
الکترووفورز و رنگ آمیزی ژل آگارز
برای رنگ آمیزی ژل آگارز دو روش وجود دارد:
- هنگامی که ژل آگارز حل شده و تا حدی که دست را نسوزاند سرد شد (دمای 37درجه سانتی گراد)، حدود g/ml2µ/0 تا 5/0 اتیدیوم برماید به آن اضافه کنید (معمولا 2-3 میکرولیتر از استوک آزمایشگاهی برای 100 میلی لیتر ژل) و سپس آن را درون تانک الکتروفورز قرار دهید. (اما باید توجه داشته باشید، تانک الکتروفورز و تمامی وسایل آن باید جدا باشند تا اتیدیوم برماید بخش های دیگر را آلوده نکند، زیرا اتیدیوم برماید یک ماده سرطان زا بوده، با دستکش و وسایل مختص بخش الکتروفورز با آن کار کنید و محض تماس با پوستتان آن را با آب فراوان بشویید.)
- روش دیگر این است که پس از پایان الکتروفورز، ژل را درون ظرفی حاوی میزان زیاد محلول اتیدیوم برماید قرار دهید تا ژل رنگ شود. اما این روش به دلیل احتمال بیشتر آلودگی توضیه نمیشود.
مشاهده ی باندهای DNA
پس از اتمام حرکت مولکول‌ها به سمت قطب مخالف، جریان الکتریکی را قطع کرده و ژل توسط دستگاه ژل داک که از نور UV برای آشکار سازی رنگ‌های فلورسنت استفاده میکند، تصویر برداری شود.
الکترووفورز
نکته: میتوانید از نوعی رنگ امن تر به نام safe stain استفاده کنید. اما بدانید این رنگ نیز سمی است و کاملا امن نیست (هر ماده ای که به DNA متصل میشود امن نیست).