کلونینگ DNA

آموزش مهندسی ژنتیک – اهداف و روش کلونینگ ژن

 

در این مقاله از پویاژن آزما میخواهیم به تعریف کلی و ساده از کلونینگ ژن و مراحل انجام آن بپردازیم

 

 برای تولید پروتئین نوترکیب و واکسن های نوتریکیب باید ژن آن پروتئین را در یک میزبان مناسب کلون و بیان کنید. آزمایشگاه پویاژن آزما دارای تجهیزات و با حضور متخصصین حوزه مهندسی ژنتیک آماده است تا تمامی بخش های کلونینگ DNA برای مشاوره و آموزش عملی مهندسی ژنتیک به تمامی علاقمندان و محققان انجام دهد. برای توضیحی ساده از مراحل و روش کلونینگ DNA این مقاله را مطالعه و کلیپ زیر را مشاهده کنید.

 

کلونینگ DNA چیست؟

وقتی کلمه کلونینگ را می شنوید، ممکن است به شبیه سازی کل موجودات مانند گوسفند دالی فکر کنید. با این حال، کلون کردن چیزی یعنی ساختن کپی دقیق ژنتیکی از آن. در آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی، آنچه بیشتر کلون می شود، ژن یا قطعه کوچک دیگری از DNA است.

کلونینگ فرآیند ساخت کپی های متعدد و یکسان از قطعه خاصی از DNA است. در کلونینگ DNA، ژن یا قطعه DNA موردنظر (مثلا یک ژن مربوط به پروتئین انسانی مهم) ابتدا در یک قطعه حلقوی DNA به نام پلاسمید قرار می گیرد. این کار با استفاده از آنزیم هایی انجام می شود که DNA را “cut and paste” می کنند و یک مولکول DNA نوترکیب یا DNA ترکیب شده از قطعات منابع مختلف، تولید می کند.

پلازمید نوترکیب

تصویر شماتیک از انتقال یک ژن خاص به درون پلازمید و ایجاد DNA نوترکیب

 

سپس، پلاسمید نوترکیب به باکتری ها وارد می شود. باکتری های حامل پلاسمید انتخاب شده و رشد می کنند. هنگام تولید مثل ، آنها پلاسمید را تکثیر کرده و به نسل بعدی خود منتقل می کنند و نسخه هایی از DNA موجود در آن را تهیه می کنند.

هدف کلونینگ DNA

ساخت نسخه های زیادی از توالی DNA در یک پلاسمید چه فایده ای دارد؟ 

در بعضی موارد، برای انجام آزمایشات یا ساختن پلاسمیدهای جدید، به نسخه های DNA زیادی نیاز داریم. در موارد دیگر، قطعه DNA یک پروتئین مفید را رمزگذاری می کند و از باکتری ها به عنوان “کارخانه” برای تولید پروتئین استفاده می شود.

با کلونینگ DNA شما میتوانید ژن یک پروتئین را در یک میزبان بیان کنید و بتوانید در مدت زمان کوتاه مقدار بسیار زیاد از یک پروتئین داشته باشید. همانطور که پروتئین انسولین، واکسن هپاتیت B و بسیاری پروتئین و واکسن دیگر تا کنون تولید شده اند و امروزه این بحث برای ساخت واکسن کرونا و برخی انواع درمان کرونا مورد استفاده قرار میگیرد. همچنین برای ساخت پروتئین های خوراکی نیز میتواند مورد استفاده قرار گیرد.

مولکول های DNA ساخته شده از طریق تکنیک های کلونینگ برای بسیاری از اهداف در زیست شناسی مولکولی استفاده می شود. یک لیست کوتاه از مثالها:

تولید داروهای بیولوژی: از کلوینگ DNA می توان برای ساخت پروتئین های انسانی با کاربردهای پزشکی مانند انسولین که در بالا ذکر شده استفاده کرد.

ژن درمانی: در برخی از اختلالات ژنتیکی، بیماران فاقد شکل عملکردی یک ژن خاص هستند. ژن درمانی سعی دارد نسخه طبیعی ژن را به سلولهای بدن بیمار ارائه دهد.

آنالیز ژن: در آزمایشگاه های تحقیقاتی پایه، زیست شناسان اغلب از کلونینگ DNA برای ساختن نسخه های مصنوعی و نوترکیب ژن استفاده می کنند که به آنها کمک می کند ژن های طبیعی موجود زنده را درک کنند.

موارد استفاده کلونینگ DNA بسیار نامحدود است و محدودیت استفاده مفید از آن فقط در ذهن ماست. میتوانید از سایت khanacademy به زبان انگلیسی توضیحات این تکنیک مهم را مطالعه کنید.

مراحل کلونینگ DNA

به عنوان مثال، بیایید ببینیم که چگونه می توان از شبیه سازی DNA برای سنتز پروتئینی (مانند انسولین انسانی) در باکتری ها استفاده کرد. مراحل اساسی عبارتند از:

  1. پلاسمید را برش داده و ژن را “paste” کنید. این فرایند را آنزیم های محدود کننده (DNA را قطع می کند) و DNA لیگاز (که به DNA را بهم میچسباند) انجام میدهند.
  2. پلاسمید را درون باکتری ها قرار دهید. برای شناسایی باکتری های حامل پلاسمید از انتخاب آنتی بیوتیک استفاده کنید.
  3. مقدار زیادی باکتری حامل پلاسمید را کشت داده و از آنها به عنوان “کارخانه” برای تولید پروتئین استفاده کنید. پروتئین را از باکتری ها برداشت کرده و آن را تخلیص کنید.

بیایید هر مرحله را با دقت بررسی کنیم.

۱. برش و چسباندن DNA

چگونه می توان قطعات DNA از منابع مختلف را به هم متصل کرد؟

در یک روش معمول از دو نوع آنزیم استفاده می شود: آنزیم های محدود کننده و DNA لیگاز.

آنزیم محدود کننده نوعی آنزیم برش دهنده DNA است که توالی هدف خاصی را شناسایی میکند و DNA را در نزدیکی انتهای آن برش میدهد. بسیاری از آنزیم های محدود کننده باعث ایجاد کوتاه و تک رشته (انتهای چسبنده) میشوند. اگر دو مولکول DNA دارای انتهای چسبنده مکمل باشند، می توانند جفت شده و بهم بچسبند. با این حال، تا زمانی که توسط DNA لیگاز، که شکاف های DNA را مهر و موم می کند، به یکدیگر متصل نشوند، ثابت با هم نمی مانند. برای توضیحات بیشتر درباره مرحله دایجستشن (برش آنزیمی) به مقاله دایسجتشن مراجعه کنید.

عملکرد آنزیم محدودکننده و لیگاز

تصویر شماتیک از عملکرد یک آنزیم محدودکننده و DNA لیگار

 

برای رسیدن به توالی مورد نظر در کلونینگ DNA ژنوم نمونه حاوی آن توالی را استخراج کنید و با پرایمرهای اختصاصی PCR انجام دهید تا مقدار ژن اختصاصی زیاد شود. همچنین پلازمید را استخراج کرده و سپس در معرض آنزیم محدود کننده موردنظر و سپس آنزیم DNA لیگاز قرار دهید. 

 

برای خرید کیت استخراج میتوانید از این لینک استفاده کنید. 

 

 

هدف ما از کلونینگ، قرار دادن یک ژن هدف (به عنوان مثال انسولین انسانی) در یک پلاسمید است. با استفاده از یک آنزیم محدود کننده که با دقت انتخاب شده، ژن و پلازمید را برش میدهیم:

  • انتخاب پلاسمید که دارای یک محل برش واحد و مناسب است.
  • قطعه ژن هدف که نزدیک هر انتها دارای یک محل برش برای آن آنزیم است.

سپس، قطعات را با DNA لیگاز ترکیب می کنیم که آنها را بهم پیوند می دهد و یک پلاسمید نوترکیب حاوی ژن ایجاد می کند.

تصویر پلازمید نوترکیب

تصویر شماتیک از ایجاد برش و انتقال ژن مورد نظر به پلازمید و ایجاد پلازمید نوترکیب برای انتقال به باکتری

 

۲. انتقال به باکتری و انتخاب باکتری حامل پلازمید در کلونینگ DNA

پلاسمیدها و سایر DNA ها می توانند در فرآیندی به نام ترنسفورمیشن یا انتقال، به باکتری ها وارد شوند، معمولا از E. coli غیر بیماریزا که در آزمایشگاه ها استفاده می شود. در انتقال به سلولهای باکتری که به طور ویژه آماده شده اند شوک دمایی داده می شود (مانند درجه حرارت بالا) که آنها را به گرفتن DNA خارجی ترغیب می کند.

لانتقال به باکتری

انتقال پلازمیدهای نوترکیب با استفاده از شوک دمایی به باکتری

چرا با شوک دمایی باکتریها میتوانند DNA خارجی را دریافت کنند؟

این فرایند همچنان عجیب است و کسی جواب کاملا مطمئنی به این سوال نداده است. اما به نظر میرسد که شوک حرارتی سیالیت غشا را تغییر می دهد و/یا باعث ایجاد منافذ (سوراخ ها) می شود، و عبور DNA و ورود به سلول را آسان تر می کند. 1

در کلونینگ ژن، پلاسمید معمولاً حاوی یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک است، که زنده ماندن باکتری ها در حضور یک آنتی بیوتیک خاص را امکان پذیر می کند. بنابراین، باکتریهایی که پلاسمید را گرفته اند می توانند در پلیت حاوی آنتی بیوتیک انتخاب شوند. باکتری های فاقد پلاسمید می میرند، در حالی که باکتری های حامل یک پلاسمید می توانند زنده مانده و تولید شوند. هر باکتری زنده مانده یک گروه کوچک نقطه مانند یا کلنی ایجاد می کند که از باکتری های یکسان که همگی پلاسمید یکسانی را حمل می کنند، تشکیل شده است.

کشت باکتریهای ترنسفورم شده

بعد از ترنسفورم باکتریها آنها را برای انتخاب کلونی در محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک کشت دهید.

 

همه کلنی ها لزوماً حاوی پلاسمید مناسب نخواهند بود. این به این دلیل است که در حین چسبیدن دو انتهای DNAها، قطعات DNA همیشه دقیقاً به همان طریقی که ما قصد داریم “چسبیده” نمی شوند. ما باید DNA را از چندین کلنی جمع کنیم و ببینیم که کدام حاوی پلاسمید مناسب هستند. روش هایی مانند هضم با آنزیم محدود کننده مناسب و  PCR معمولاً برای بررسی پلاسمیدها استفاده می شوند. به این صورت باکتری های کلون شده را انتخاب میکنیم و کلونینگ DNA انجام شده است.

۳. تولید پروتئین

هنگامی که ما یک کلنی باکتری حامل پلاسمید مناسب پیدا کردیم، می توانیم میزان زیادی از باکتریهای حامل پلاسمید را کشت دهیم. سپس، ما یک سیگنال شیمیایی به باکتری ها می دهیم که به آنها دستور می دهد پروتئین مورد نظر را بسازند. با استفاده از این سیگنال، باکتری ها به عنوان “کارخانه های کوچک” عمل می کنند و بیان مقدار زیادی پروتئین غیر ضروری را خاموش میکنند. به عنوان مثال، اگر پلاسمید ما حاوی ژن انسولین انسانی باشد، باکتری ها شروع به رونویسی ژن انسولین و ترجمه mRNA می کنند تا مولکولهای زیادی از پروتئین انسولین انسانی تولید کنند.

بیان پروتئین توسط باکتری

کشت باکتریهای کلون شده به میزان زیاد و تحریک آنها به بیان ژن مورد نظر. درنتیجه تولید میزان زیادی از پروتئین

 

پس از تولید پروتئین، می توان بسته به نوع بیان پروتئین (ترشحی یا درون سلولی) پروتئین های بیان شده را تخلیص کرد. بسیاری از پروتئین ها و ماکرومولکول های دیگر به غیر از پروتئین هدف (به عنوان مثال انسولین) در باکتری شناور هستند. به همین دلیل، پروتئین هدف باید خالص شود ، یا با استفاده از روش های بیوشیمیایی از سایر محتویات سلول جدا شود. پروتئین خالص شده را می توان برای آزمایش یا در مورد انسولین برای بیماران استفاده کرد.

شرکت پویاژن بطور تخصصی بر کلونینگ ژن و بیان پروتئین های نوترکیب فعالیت میکند و میتواند در زمینه آموزش و انجام پروژه ها شما را راهنمایی کند.

 

برای مراجعه به صفحه تصفیه فاضلاب صنعتی میتوانید از این لینک استفاده کنید .

 

برای خرید کیت استخراج میتوانید از این لینک استفاده کنید. 

 

منابع برای مطالعه درباره کلونیگ DNA

  1. Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., … Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

برای مطالعه ی نکات استفاده از سمپلر به اینجا بروید

سرتیترها

4 نظر در “آموزش مهندسی ژنتیک – اهداف و روش کلونینگ ژن

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه