انواع محيط كشت ميكروبی

باکتریها مثل انسان و حیوان و گیاه برای ادامه حیات احتیاج به محیط زیست دارند که مواد لازم برای ساختمان پروتوپلاسم و تزاید آنها را دارا باشد در ضمن دارای حرارت ، فشار اسمزی و pH مناسبی نیز باشد.

آشنایی با طرز تهیه انواع محیطهای کشت میکروبی

محیطهای کشتی که در باکتریولوژی بکار برده می شوند بر دو نوعند:

1. محیط کشت های طبیعی
2. محیط کشت های مصنوعی

محیط های کشت طبیعی می توانند از منابع حیوانی و یا گیاهی باشند مثلآ سیب زمینی یا محیط هویج از دسته محیط کشت هایی با منابع گیاهی، محیط جگر و آبگوشت پپتون نمک دار و محیطهای دیگر که از عصاره گوشت در آنها استفاده می شود از محیطهای کشت طبیعی با منابع حیوانی می باشند.
محیط های کشت مصنوعی یا ترکیبی که از ترکیب مواد شیمیایی معینی ساخته می شوند و این محیط ها به علت اینکه مقدار مواد ترکیبی را همیشه در اختیار دارند و اختلافی مثل محیطهای کشت طبیعی از لحاظ منابع طبیعی ندارند برای بررسی اعمال حیاتی موجودات ذره بینی مناسبتر می باشند.

دسته بندی محیط کشت ها بر اساس حالت آن

بطور کلی محیطهای کشت در باکتریولوژی از نظر سفتی به سه دسته تقسیم می شوند :

1. محیط کشت های مایع که دارای پسوند براث(broth) می باشند مثل نوترینت براث(nutrient broth)
2. محیط کشت های نیمه جامد که دارای پسوند مدیوم (medium) هستند مثل اندول نیتریت مدیوم (indol nitrit medium) یا محیط S.I.M. که این محیط ها به علت داشتن درصد کمی از آگار برای دیدن حرکت در باکتریها مناسب است. مقدار آگار در این محیط ها 5/0-2/0% می باشد.
3. محیط کشت های جامد که دارای پسوند آگار می باشند مثل نوترینت آگار.

برای تهیه محیط های ژله ای یا جامد موادی نظیر آگار یا ژلاتین به میزان 15 تا 20 گرم در لیتر به محیط های مایع اضافه می شود.

آگار چیست؟

آگار ماده ای است که از نوعی جلبک قرمز دریایی استخراج می شود و خاصیت غذایی ندارد. ژلاتین دارای خاصیت غذایی است و تحت تآثیر بعضی از باکتریها دگرگونی حاصل کرده و در ضمن در حرارت بالاتر از 25 درجه به صورت مایع در می آید به همین علت برای سفت کردن محیطهای کشت از آگار استفاده می کنند.

انواع محیط کشت بر اساس نوع کاربرد در جداسازی باکتری ها

محیط کشت های مختلف که برای تشخیص و جدا نمودن باکتری ها بکار می روند بر سه نوعند:

1. محیط کشت مغذس: که دارای کلیه مواد لازم برای رشد باکتریها است و به علت نداشتن مواد ضد میکروبی تقریباً تمام باکتریها می توانند در چنین محیطی رشد نمایند مثلاً در محیط نوترینت آگار باکتریهای گوناگون رشد می نمایند.
2. محیط های کشت متمایز کننده: این محیطها به علت داشتن مواد مخصوص باعث تمایز بعضی از باکتریها می شوند. مثلاً محیطهای کشت E.M.B. (ائوزین متیلن بلو) و مکانکی، حاوی لاکتوز که معرفهای شیمیایی می باشند و به همین جهت باعث تمایز باکتریهایی می شوند که لاکتوز را تخمیر می کنند.
3. محیطهای کشت اختصاصی: این محیطها فقط برای رشد باکتریهای خاص مناسب است مانند محیط کشت مانیتول سالت آگار(manitol salt agar) که دارای قند مانیتول و 5/7% نمک می باشند و فقط باکتریهایی می توانند در چنین محیطی رشد کنند که مانیتول را تخمیر نمایند و در مقابل غلظت زیاد نمک طعام مقاوم باشند. استافیلوکوک بیماریزا دارای این خاصیت می باشد. بعضی از محیطهای اختصاصی حاوی آنتی بیوتیک می باشند مثلاً برای جدا نمودن استرپتوکوکهای گروه A از گلوی بیمار محیط کشتی بکار می برند که حاوی آنتی بیوتیکهای نئومایسین و پلی میکسین می باشند. این آنتی بیوتیکها از رشد باکتریهای موجود در گلو بجز استرپتوکوکهای گروه A جلوگیری میکنند.

گاهی اختصاصی بودن محیط کشت به علت فقدان ماده مخصوصی است مثلاً اگر در یک محیط کشت نمکهای مختلف و قند و آب موجود باشد اما ترکیبات آلی ازته موجود نباشد فقط تعداد محدودی از باکتریها مانند E. coli می تواند بر روی آن رشد نماید.

اصول تهیه محیط کشت

اکثر محیط های کشت مورد استفاده در باکتریولوژی امروزه به صورت پودرهای آماده موجود می باشد که برای تهیه آنها باید طبق دستور هر محیط مقدار معینی از آن را وزن کرده و با مقدار آب مناسب مخلوط کرد و برای این منظور ابتدا مقدار لازم آب را در ارلن ریخته و پودر را به تدریج در آن وارد کرده و هم می زنیم تا پودر گلوله نشود و به طور یکنواخت حل گردد. گاهی اوقات برای تهیه محیطهای کشت لازم است مقادیر لازم از مواد مختلف را کشیده و با مقدار مناسب مخلوط نمائیم. در هر صورت در مواقعی که آگار در ترکیب محیط کشت وجود دارد باید این آگار در محیط حل شود برای این منظور بعد از مخلوط کردن مقادیر لازم با آب لازم است که مواد چند دقیقه جوشانده شود تا محیط کاملاً شفاف شود. برای این منظور از بن ماری و یا شعله مستقیم می توان استفاده کرد در صورت استفاده از شعله مستقیم باید محیط را مرتب هم زد تا آگار ته نگیرد و نسوزد. بعد از آماده شدن محیط باید آن را استریل کرد. در مورد بعضی از محیطهای اختصاصی مثلاً محیط S.S. agar (سالمونلا شیگلا آگار) استریل کردن محیط لازم نیست. اگر منظور تهیه محیط در پلیت باشد(شکل e.1) محیط را در همان ارلن که درست کردیم ، استریل کرده و بعد از اتوکلاو شدن در کنار شعله گاز با رعایت شرایط استریل در پلیتها به مقدار cc 15-10 تقسیم میکنیم.

پلیت محیط کشت آگار دار

در مورد تهیه محیط در لوله، بعد از آماده کردن محیط معمولاً به میزان یک سوم لوله از محیط را در لوله ها ریخته و بعد از اتوکلاو کردن ، اگر منظور تهیه محیط شیبدار(slant) باشد(شکلb,c) باید لوله ها را بعد از اینکه از اتوکلاو خارج گردید به صورت مایل خوابانید تا بسته شود و اگر منظور تهیه

Agar tall (Agar deep tube) باشد (شکل .d) لوله ها را بصورت ایستاده قرار می دهند تا بسته شود.

انواع حالتهای محیط در لوله آزمایش و پلیت. B و C محیط کشت بصورت شیبدار

در هر صورت در تمام موارد باید دهانه لوله ها یا ارلن را قبل از اتوکلاو کردن خوب با پنبه یا دربهای مخصوص مسدود کرد و پنبه ها را باید به طریقی در لوله ها گذاشت که مقداری از پنبه در داهل لوله ومقداری هم در بیرون به طریقی باشد که به راحتی بتوان آن را برداشت و در عین حال نباید پنبه ها شل باشد که به آسانی بیفتد. محیطهای آماده شده را تا هنگام مصرف باید در یخچال نگه داشت تا از خشک شدن آن جلوگیری شود.

طرز تهیه تعدادی محیط کشت

محیط نوترینت آگار (N.A.)

برای تهیه آن 23 گرم از پودر آماده را در یک لیتر آب مقطر مخلوط می کنیم و بعد از حل شدن آگار آن را اتو کلاو کرده و سپس در کنار شعله بطور استریل در پلیت ها تقسیم می کنیم.

محیط S.I.M.

برای تهیه این محیط مقدار لازم را طبق نوشته پشت قوطی وزن کرده وبا میزان آب لازم مخلوط می نماییم و بعد از حل شدن آگار آن را در لوله ها تقسیم کرده و اتوکلاو می کنیم . بعداز اتوکلاو شدن لوله ها را بصورت ایستاده قرار می دهیم.

محیط Triple Suger Iron agar (T.S.I.)

مانند محیط S.I.M. تهیه کرده ولی موقع بسته شدن محیط بصورت مورب قرار دهید.

محیط خون دار (Blood agar)

برای تهیه محیطهای خون دار از خون خرگوش ، گوسفند یا انسان استفاده می شود که به میزان 5% به محیط پایه یا N.A. بعداز خارج کردن از اتوکلاو با رعایت شرایط استریل اضافه می شود. زمانی باید خون را به محیط پایه اضافه کرد که حرارت محیط حدود 45 درجه باشد (حرارت محیط به میزانی باشد که دست را نسوزاند و آنقدر هم سرد نشود که محیط ببندد) و بلافاصله با رعایت شرایط استریل در پلیتها تقسیم می کنیم.

محیط های قندی

برای تهیه محیط کشت های قندی از محیط Phenol red broth base استفاده میکنیم. به میزان لازم از پودر را کشیده و با مقدار مناسب آب مخلوط کرده و سپس از هر یک از قندهای مورد نظر جداگانه به میزان 1-5/0% به محیط اضافه کرده و محیط را در لوله های آزمایش که در هر کدام از آنها یک لوله دورهام به صورت وارونه قرار دارد تقسیم می کنیم و بعد از بستن در لوله ها با پنبه ، آنها را اتوکلاو می کنیم.

مواد لازم: محیط کشت های N.B. , N.A. , S.I.M. , T.S.I.
لوازم مورد نیاز : پلیت ، لوله آزمایش با در پنبه ای ، شعله گاز ، اتوکلاو
روش:
هر تیم از دانشجویان مقدار مورد نیاز جهت تهیه 50 میلی لیتر از پودر محیطهای ذکر شده را وزن کرده و در 50 میلی لیتر آب مقطر با استفاده از شعله حل کرده ، محیط های S.I.M. ، T.S.I. و N.B. را در لوله ها تقسیم کرده و سپس اتوکلاو می کند. پس از خارج کردن محیط ها از اتوکلاو ، محیط N.A. را پس از سرد شدن تا حدود50-45 درجه در کنار شعله در 3 پلیت تقسیم کنید. محیط S.I.M را بصورت عمودی و محیط T.S.I. را بصورت مورب قرار داده تا محیط ببندد. سپس محیط ها را تا انجام آزمایش بعدی در یخچال نگهداری کنید.