آموزش جامع تست IMViC

شناسایی باکتری های روده ای مهمترین مرحله در شناسایی بیماری های با منشا غذا و آب می باشد. تعدادی از باکتری هایی که در روده انسان و حیوانات دیگر یافت می گردند متعلق به خانواده انتروباکتریاسه آ هستند. این باکتری ها کوتاه، گرم منفی، میله ای بدون اسپر هستند. این باکتریها را می توان به تخمیر کننده ها و غیر تخمیر کننده های لاکتوز تقسیم کرد.

بیماریزاها مانند سالمونلا و شیگلا (غیر تخمیر کننده لاکتوز) ، بیماریزاهای اتفاقی مانند کلبسیلا و اشریشیا (تخمیر کننده لاکتوز) و پروتئوس (غیر تخمیر کننده لاکتوز.) تشخیص و افتراق بین این باکتریها را می توان بوسیله استفاده از تست IMViC (اندول ، متیل رد ، VPو سیترات) انجام داد. در این مقاله آزمایشگاه همکار غذا و دارو پویاژن آزما قصد دارد بطور مفصل به توضیح اصول و نکات تست IMViC یا تست ایمویک بپردازد.

نکات ایمنی تست IMViC

معرف Barritt دارای نفتول بوده و سمی است و ممکن است باعث آسیب به پست گردد بنابراین وقتی از این معرف استفاده می کنید دستکش دست کنید. معرف کواکس نیز به علت دارا بودن اسید کلریدریک غلیظ شده و -p دی متیل آمینوبنزالدئید می تواند برای پوست مضر باشد. در صورتیکه با این معرفها آلوده شدید، فورا چشمها یا دستهای خود را به مدت 00دقیقه با آب شستشو دهید.

مواد موردنیاز برای تست IMViC

• کشت 24-48 ساعته انتروباکتر آئروژنز،E. coli، کلبسیلا اکسیتوکا و پروتئوس ولگاریس در محیط TSB
• چهار لوله SIM
• معرف کواکس
• قرص تست اندول
• KEY یا معرف کواکس اندول
• تست نقطه ای
• شعله
• لوپ
• سوزن کشت
• چهار لوله محیط مایع (0ml( MR-VP
• معرف متیل رد
• معرف Barritt (محلول A و B) یا معرف Aو B تست نقطه ایVP
• چهار محیط شیب دار سیمون سیترات
• چهار لوله آزمایش خالی
• پیپت 8 ml با پیپتور
• دستکش یکبار مصرف

خرید اینترنتی محصولات بیوتکنولوژی

مواردی که در تست IMViC یاد میگیرید:

هر دانشجو باید بتواند:

1. چگونگی تجزیه اسید آمینه تریپتوفان بوسیله باکتری را درک کند.
2. توانایی بعضی از باکتریها را در اکسیده کردن گلوکز با تشکیل اسید به عنوان محصول نهایی را مشخص کند.
3. بتواند باکتریهای روده ای تخمیر کننده گلوکز را از یکدیگر تشخیص بدهد.
4. هدف از آزمایش Voges – Proskauer را توضیح دهد.
5. بتواند باکتری های روده ای را بر اساس توانایی آنها در تخمیر سیترات از یکدیگر تشخیص دهد.
6. آزمایشهای سری IMViCرا بخوبی انجام دهد.

کاربرد پزشکی تست IMViC

باکتری های مهم از نظ پزشکی زیر MRمثبت هستند. اشریشیا کلی (عفونت فرصت طلب مجرای ادرار) ، سالمونلا تیفی (تب تیفوئید) ، شیگلا دیسانتری (اسهال باکتریایی) و یرسینیا پستیس(طاعون.) باکتری انتروباکتر آئروژنز (عفونت مجرای ادرار) MRمنفی است. بوردتلا پرتوسیس (سیاه سرفه) ، سیترات منفی است در حالیکه بقیه گونه های بوردتلا سیترات مثبت هستند. باکتریهای روده ای نظیر کابسیلا پنومونیا (ذات الریه) و انتروباکتر سیترات مثبت بوده و می توان آنها را از بیماریزاهای فرصت طلب اشریشیا کلی (عفونت مجرای ادرار) که سیترات منفی هستند جدا کرد..

تولید اندول

اسید آمینه تریپتوفان تقریبا در تمام پروتئینها وجود دارد. باکتریهایی که دارای آنزیم تریپتوفاناز هستند می توانند تریپتوفان را به محصولات متابولیکی که اندول ، پیرویک اسید و امونیوم هستند هیدرولیز کنند. باکتریهایی که پیرویک اسید و آمونیوم را جهت بر طرف کردن نیاز خود استفاده می کنند از اندول استفاده نکرده و در محیط تجمع می یابد.

حضور اندول را می توان با استفاده از معرف کواکس نشان داد. معرف کواکس با اندول واکنش داده و یک ترکیب قرمز روشن روی سطح محیط ایجاد می کند. باکتریهایی که این لایه قرمز روشن را ایجاد کنند اندول مثبت هستند. عدم ایجاد رنگ قرمز نشان دهنده این است که تریپتوفان هیدرولیز نشده و باکتری اندول منفی است.

پروتکل آزمایش تولید اندول

مرحله اول

1. نام خود، تاریخ و نام هر باکتری که قرار است کشت داده شود (باکتریهای اشریشیاکلی ، پروتئوس ولگاریس و انتروباکتر آئروژنز) را بر روی هر لوله SIMبنویسید. (اگر محیط SIMدر دسترس نبود محیط TSB جهت آزمایش تولید اندول مناسب است.)
2. بصورت استریل هر لوله را با سوزن کشت بصورت عمقی کشت دهید.
3. لوله ها را به مدت 24 ساعت در 35 درجه قرار دهید.

مرحله دوم

1. در حالیکه دستکش در دست دارید ( 5/0ml حدود 10 قطره) معرف کواکس به هر لوله اضافه کنید و به آرامی هم زنید. رنگ قرمز پر رنگ در حضور اندول ظاهر می گردد. نمونه های منفی بدون رنگ باقی مانده و یا زرد روشن می شوند.
2. بر اساس مشاهدات خود نتایج را یادداشت کنید.

آزمایش اندول. لوله سمت چپ اندول منفی و لوله سمت راست اندول مثبت است.

آزمایش اندول با قرص .KEY رنگ قرمز چند دقیقه بعد از اضافه کردن قرص KEY ایجاد می گردد. لوله سمت چپ نمونه مثبت و لوله سمت راست (بدون رنگ) نمونه منفی

آزمایش متیل رد

تمام باکتری های روده ای جهت نیاز انرژی خود کاتابولیز می کنند در حالیکه محصول نهایی بر اساس مسیر آنزیمی باکتری متفاوت است. معرف متیل رد تغییرات pHدر اثر تولید اسیدهای مختلف نظیر لاکتیک ، استیک و فرمیک اسید را شناسایی می کند. این تست در تفاوت گذاشتن بین ( E. coliتخمیر کننده مخلوط اسید) و انتروباکتر آئروژنز (تخمیر کننده بوتان دیول) ارزشمند است.

تخمیر کننده های مخلوط اسید نظیر اشریشیا کلی ترکیبی از اسیدهای تخمیر شده را تولید می کنند در نتیجه محیط کشت اسیدی می گردد. تخمیر کننده های بوتان دیول نظیر انتروباکتر آئروژنز بوتاندیول، استن و چند اسید آلی تشکیل می دهند که pHمحیط پایینتر از تخمیر مخلوط اسید نمی آید. همانطور که در شکل نشان داده شده است در pH، معرف متیل رد قرمز می شود در نتیجه تست متیل رد مثبت می گردد. در ، pH =6 معرف زرد می شود که نشان دهنده متیل رد منفی است.

پروتکل آزمایش متیل رد

مرحله اول

1. نام خود، تاریخ و نام هر باکتری که قرار است کشت داده شود(باکتریهای اشریشیاکلی ، انتروباکتر آئروژنزو کلبسیلا اکسی توکا) را بر روی هر لوله MR-VP بنویسید.
2. هر لوله را با میزان مناسبی از باکتری با استفاده از لوپ کشت دهید.
3. لوله ها را به مدت 24-48 ساعت در 35 درجه قرار دهید. در مورد باکتری هایی که به آرامی تخمیر انجام می دهند ممکن است 4-5 روز لازم باشد.

مرحله دوم

1. جهت بررسی 3/1 ، VP از محیط هر لوله را به لوله آزمایش خالی دیگری انتقال دهید.
2. به 3/2 باقی مانده ( 0.2ml حدود 5-4 قطره) از معرف متیل رد اضافه کنید و سپس تغییر رنگ را یادداشت کنید( رنگ قرمز مثبت است).

آزمایش متیل رد. (a) اشریشیاکلی، + (b) . MRانتروباکتر آئروژنز، -MR

تست Voges-proskauer

این تست باکتری هایی را که گلوکز را تخمیر کرده و باعث تجمع 2و3-بوتاندیول در محیط می شوند را شناسایی می کند. اضافه کردن KOH %40و محلول %5 آلفا نفتول در اتانل خالص (معرف Barritt) حضور استوئین (یک پیش ساز در سنتز 2و3بوتاندیول) را مشخص می کند. در حضور معرف و استوئین رنگ قرمز گیلاسی ظاهر میگردد. ظاهر شدن رنگ قرمز 00دقیقه بعد از اضافه کردن معرف نشان دهنده تست VPمثبت است و عدم تشکیل رنگ تست VP منفی است.

پروتکل آزمایش voges – proskauer

1. در حالیکه دستکش در دست دارید، 6/0 ml از محلول A باریت و 2/0 mlاز محلول B باریت را به هر کدام از لوله ها ( 3/1 جدا شده) اضافه کنید و به شدت به نحوی که هوا به آن برسد هم بزنید. واکنش مثبت سریع یا در خلال 41دقیقه رخ داده و با ایجاد رنگ قرمز مشخص می گردد.
2. نتایج را بر اساس مشاهدات خود یادداشت کنید.

آزمایش وژس پروسکوئر (a) . (Voges Proskauer) انتروباکتر آئروژنز ، + (b) .VPاشریشیاکلی -VP

آزمایش مصرف سیترات

آزمایش مصرف سیترات توانایی باکتری را در استفاده از سیترات به عنوان منبع کربن جهت تامین انرژی مشخص می کند. این توانایی متکی به وجود سیترات پرمئاز است که انتقال سیترات به داخل باکتری را مقدور می سازد. سیتراتی که وارد باکتری می گردد به اسید پیرویک و CO2 تبدیل می گردد. محیط شیب دار سیمون سیترات آگار دارای سیترات سدیم به عنوان منبع کربن، + NH4 به عنوان منبع نیتروژن و بروموتیمول بلو به عنوان معرف pH می باشد.

این آزمایش بر روی شیب محیط ایجاد می گردد زیرا اکسیژن جهت مصرف سیترات لازم می باشد. وقتی باکتری سیترات را اکسید می کند در واقع آن را از محیط حذف کرده و CO2آزاد می کند. CO2 با سدیم ( که بصورت سیترات سدیم استفاده شده است) و آب ترکیب شده و کربنات سدیم که یک محصول قلیایی است تولید می شود در نتیجه pHافزایش یافته و معرف آبی رنگ می گردد که نشانگر آزمایش سیترات مثبت است. در صورت عدم تغییر رنگ آزمایش سیترات منفی می باشد(شکل .)0نمونه سیترات منفی می تواند بصورت عدم رشد بر روی محیط نیز نشان داده شود.

پروتکل آزمایش مصرف سیترات

مرحله اول

1- نام خود، تاریخ و نام هر باکتری که قرار است کشت داده شود(باکتریهای اشریشیاکلی ، انتروباکتر آئروژنز و کلبسیلا اکسی توکا) را بر روی هر لوله حاوی محیط شیب دار سیمون سیترات آگار بنویسید.

2- بصورت استریل هر لوله را با باکتری مربوطه بصورت سطحی و عمقی کشت دهید.

3- لوله را مدت 24-48 ساعت در 35 درجه قرار دهید.

مرحله دوم

1. هر لوله را از نظر رشد و تغییر رنگ از سبز به آبی بررسی کنید.
2. بر اساس مشاهدات خود نتایج را یادداشت کنید. مشخص کنید که کدام باکتری قادر به مصرف سیترات میباشد. ایجاد رنگ آبی نشان دهنده مثبت می باشد.

آزمایش سیترات. (a) انتروباکتر آئروژنز؛ رنگ آبی نشان دهنده مثبت. (b) اشریشیاکلی ؛ رنگ سبز نشان دهنده منفی

نکات لازم تست ایمویک

1. لوله های SIM را فقط 24 ساعت قبل از اضافه کردن معرف کواکس انکوبه کنید زیرا ممکن است اندول در اثر انکوباسیون طولانی متابولیزه گردد که این باعث نتیجه منفی کاذب در مورد بعضی از باکتریهایی که تولید کننده اندول از تریپتوفان هستند، شود.
2. آزمایش تولید اندول را می توان با اضافه کردن معرف کواکس به محیط TSB نیز انجام داد.
3. بیشتر از 5 قطره از متیل رد اضافه نکنید. بیشتر از آن ممکن است باعث ایجاد رنگ قرمز بدون ارتباط با محصولات نهایی متابولیکی اختصاصی گردد.
   در زیر جداول مناسب یادداشت نتایج آزمایشات آمده است.

جدول تست imvic

جدول ثبت نتایج آزمایش اندول

جدول ثبت نتایج MR-VP

جدول ثبت نایج آزمایش مصرف سیترات

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید درباره نکات کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی درباره آنزیم بتاگالاکتوزیداز مطالعه کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده باشد، اگر به این مبحث علاقمند هستید، میتوانید از این منبع: IMViC Tests: Principle, Procedure, Results (زبان انگلیسی)درباره آنزیم بتاگالاکتوزیداز مطالعه کنید.

شرکت دانش بنیان پویاژن آزما، تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر می باشد.