استخراج RNA

استخراج RNA با ترایزول (2)

استخراج RNA با ترایزول

 

در این مقاله از طرف پویاژن می خواهیم به ادامه بحث استخراج RNA با ترایزول بپردازیم .

در این قسمت هر یک از مراحل کار را که به صورت موردی در قسمت اول نام برده بودیم را شرح می دهیم

 

1 – هموژنیزه کردن نمونه  برای استخراج RNA

بافت: برای استخراج RNA هر 50 تا 100 میلی گرم از نمونه های بافت را در یک میلی لیتر ®TRIzol با استفاده از شیشه-تفلون یا هموژنایزرهمگن کنید. در کل حجم نمونه نباید بیشتر از 10٪ ®TRIzol استفاده کرد.

سلول (رشد کرده بصورت تک لایه): برای استخراج RNA از سلولهای چسبیده به فلاسک، آنها را با PBS سرد شستشو دهید. سلولها را با افزودن 1 میلی لیتر معرف ورتکس کنید و محلول حاوی سلول های لیز شده را چندین بار پیپتاژ و ورتکس کنید. مقدار معرف ®TRIzol اضافه شده بر اساس سطح ظرف کشت (1 میلی لیتر در هر 10 سانتی متر مربع) است و نه بر اساس تعداد سلول های موجود. مقدار ناکافی از ®TRIzol ممکن است منجر به آلودگی DNA  در RAN استخراجی شود.

سلولهایی که بصورت شناور رشد میکنند: برای استخراج RNA از این سلول ها. آنها را به مدت 5 دقیقه درg  ×300  سانتریفیوژ کنید. محیط کشت را دور بریزید و سلولها را در PBS سرج مجدداً سوسپانسیون کنید. سلول ها به مدت 5 دقیقه درg  ×300  سانتریفیوژ کنید.سپس ®TRIzol را افزوده و با پیپتاژ کردن یا عبور از سرنگ، سلولها را لیز کنید. برای هر ۱۰۶ × 5-10 سلول حیوانی، از 1 میلی لیتر معرف استفاده کنید.

نمونه همگن شده از سلولها را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوباسیون کنید تا تفکیک کامل کمپلکس های نوکلئوپروتئین امکان پذیر شود. سپس برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای استخراج RNA به میکروتیوب جدید منتقل کنید.

 

2 – جداسازی فازها برای استخراج RNA

به ازای هر 1 میلی لیتر ®TRIzol  ۲/۰ میلی لیتر کلروفرم اضافه کنید. از لوله های در دار استفاده کنید (به دلیل سمیت کلروفرم). نمونه ها را به مدت 15 ثانیه با شدت ورتکس کنید و به مدت 2 تا 3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. نمونه ها را حداکثر در  g× 12000 به مدت 15 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتریفیوژ کنید. پس از سانتریفیوژ به سه لایه تقسیم میشود، لایه پایین تر قرمز رنگ که فنل کلروفرم است، یک فاز میانی و یک فاز آبی در بالا که بی رنگ است. RNA فقط در فاز آبی (رویی) حضور دارد. فاز رویی را با احتیاط و بدون ایجاد ورود به فازهای دیگر، به میکروتیوب جدید منتقل کنید. حجم فاز آبی را اندازه گیری کنید (حجم فاز آبی حدود 60٪ حجم ®TRIzol است که در مرحله اول استفاده شد).

 

 برای خرید کیت استخراج وارد فروشگاه کیت استخراج شوید .

 

3 – رسوب RNA

با افزودن الکل ایزوپروپیل به فاز آبی، RNA را از فاز آبی رسوب میدهیم. از 0.5 میلی لیتر ایزوپروپیل الکل به ازای هر 1 میلی لیتر ®TRIzol برای همگن سازی اولیه استفاده کنید. نمونه ها را در دمای 15 تا 30 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه کرده و در حداکثرg  × 12000 به مدت 10 دقیقه در دمای 2 تا 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. رسوب RNA ، که اغلب قبل از سانتریفوژ قابل مشاهده نیست، پس از سانتریفیوژ یک رسوب ژله مانند در کنار و پایین لوله ایجاد می کند.

 

4 – شست و شوی RNA

برای استخراج RNA بصورت مناسب، مایع رویی را کاملاً بردارید. رسوب RNA را یک بار با 75٪ اتانول بشویید، حداقل 1 میلی لیتر اتانول 75٪ به ازای هر 1 میلی لیتر از ®TRIzol که در مرحله اول استفاده شد، اضافه کنید. نمونه ها را با ورتکس و سانتریفیوژ در حداکثر g  × 7،500 به مدت 5 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد مخلوط کنید. این مرحله را یک بار تکرار کنید و تمام اتانول باقیمانده را خارج کنید .

 

5 – رسوب دوباره ی RNA

در ادامه مراحل استخراج RNA، رسوب RNA در مجاورت هوا یا با استفاده از خلا به مدت 5-10 دقیقه خشک شود. با استفاده از سانتریفیوژ در خلا خشک نکنید. اجازه ندهید که رسوب RNA کاملاً خشک شود زیرا این امر باعث کاهش حلالیت آن می شود. نمونه های RNA که کم حل شده اند دارای نسبت A260 / A280 <1.6 هستند. با چند بار پیپتینگ محلول RNA آن را در آب DEPC (Rnase free) حل کنید .

 

6 – بررسی خلوص RNA استخراج شده توسط استپکتوفوتومتر

1 میکرولیتر RNA را با 39 میکرولیتر آب DEPC رقیق کنید (رقت 1:40). برای تعیین غلظت و خلوص نمونه، با استفاده از میکرو کووت 10 میکرولیتری، OD را در 260 نانومتر و 280 نانومتر بخوانید. نسبت A260 / A280 باید بالاتر از 1.6 باشد. این قانون را هم اعمال کنید که  OD 1 در 260 برابر با 40 میکروگرم در میلی لیتر RNA است. بهتر این هست که غلظت را با دستگاه نانودراپ اندازه بگیرید.

برای مطالعه بیشتر در مورد تصفیه فاضلاب صنعتی به این لینک وارد شوید  .

 

برای مطالعه ی بیشتر در این زمینه به اینجا بروید . همچنین برای دریافت مقاله در همین موضوع نیز می توانید اینجا را بزنید و سپس مقاله را دریافت بفرمایید .

 

سرتیترها

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
برای دیدن نوشته هایی که دنبال آن هستید تایپ کنید.
فروشگاه