در این مقاله از پویاژن می خواهیم به موضوع استخراج RNA با ترایزول بپردازیم .
شما برای بررسی بیان یک ژن بصورت RNA ابتدا باید از نمونه موردنظر که می تواند بافت، سلول، خون و… باشد کل RNA را استخراج کنید. روشهای استخراج RNA متفاوتی وجود دارد که رایجترین آنها استفاده از ترایزول است.
مزایا و معایب ترایزول
مدتهاست که برای استخراج RNA از ®TRIzol استفاده می شود. تا آنجا که سایر شرکتهای تجاری معرف های مشابهی را با نامگذاری خاص خود ارائه می دهند . مانند TRI Reagent® ، RNAzol® ، QIAzol® ، TriPure ، TriSure و … .
این معرف یک قابلیت عالی برای لیز انواع نمونه های پیچیده را دارد. TRIzol® برای جابجایی ورودی های بسیار زیاد به راحتی مقیاس پذیر است . یعنی در حجم های کم و زیاد قابل استفاده است، میزان کافی RNA را بازیابی می کند . همچنین غیرفعال کننده مؤثر RNases است و از تخریب نمونه ها در هنگام استخراج RNA جلوگیری می کند.
با این وجود، موانع عمده ای در این روش پر زحمت وجود دارد . مانند استفاده از کلروفرم، زمان های طولانی سانتریفیوژ و نیاز به مراحل رسوب دهی در طی فرآیند جداسازی . این روش می تواند دست و پا گیر باشد و برای اطمینان از استخراج میزان کافی از آر ان ای از نمونه ها به مهارت فنی نیاز دارد.
ترایزول چیست؟
®TRIzol معرفی بر پایه اسید-گوانیدینیوم-فنول است که برای استخراج RNA (و همچنین DNA و پروتئین) از ورودی های مختلف نمونه بیولوژیک طراحی شده است . pH پایین (اسیدی) ® TRIzol باعث می شود RNA از DNA و پروتئین جدا شود . در حالی که pH بالا می تواند باعث جدا شدن RNA و DNA با هم شود و RNA و DNA را از هم جدا نمی کند . نمک گوانیدینیم به عنوان یک عامل کاتروپیک برای بهم زدن ساختار پروتئین ها و دینیچر شدن آن ها عمل می کند و فنل (که معمولاً به رنگ صورتی دیده می شود) یک ترکیب آلی است که برای استخراج اسیدهای نوکلئیک و پروتئین نیز استفاده می شود.
تصویری از مرحله ای که سه فاز محلول در میکروتیوب دیده میشود که فاز آبی حاوی RNA است و با ایزوپروپانول میتوان RNA محلول را رسوب داد
مواد موردنیاز
آب مقطر DEPC (Rnase Free)
TRIzol
بافر PBS سرد
اتانول ۷۰٪
ایزوپروپیل الکل
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
ابزارهای موردنیاز
سانتریفیوژ یخچال دار
میکروفیوژ
سمپلر
سرسمپلرهای Rnase free
وورتکس
دستکش بدون پودر
میکروتیوب Rnase free
نکته حفاظتی مهم: در طول کار حتما از دستکش و محافظ چشم استفاده کنید . زیرهود کار کنید و بخار ترایزول را تنفس نکنید .
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
مراحل استخراج
- هموژنیزه کردن نمونه برای استخراج RNA
- جداسازی فازها برای استخراج RNA
- رسوب RNA
- شست و شوی RNA
- رسوب دوباره ی RNA
- بررسی خلوص RNA استخراج شده توسط استپکتوفوتومتر
طی مراحل بالا یعنی در شش مرحله این کار یعنی استخراج صورت می گیرد . هر یک از مراحل توضیحاتی دارد . در قسمت دوم این مقاله به توضیحات می پردازیم و راجع به هر یک شرحی خواهیم داشت تا به طور کامل این مطلب برای شما همراهان پویاژن به خوبی هر چه تمام تر جا بیفتد.
هموژنیزه کردن نمونه برای استخراج RNA
اگر نمونه مورد نظر بافت است: برای استخراج RNA هر 50 تا 100 میلی گرم از نمونه های بافت را در یک میلی لیتر ®TRIzol با استفاده از شیشه-تفلون یا هموژنایزرهمگن کنید. در کل حجم نمونه نباید بیشتر از 10٪ ®TRIzol استفاده کرد.
اگر نمونه شما سلول(رشد کرده بصورت تک لایه) است: برای استخراج RNA از سلولهای چسبیده به فلاسک، آنها را با PBS سرد شستشو دهید. سلولها را با افزودن 1 میلی لیتر معرف ورتکس کنید و محلول حاوی سلول های لیز شده را چندین بار پیپتاژ و ورتکس کنید. مقدار معرف ®TRIzol اضافه شده بر اساس سطح ظرف کشت (1 میلی لیتر در هر 10 سانتی متر مربع) است و نه بر اساس تعداد سلول های موجود. مقدار ناکافی از ®TRIzol ممکن است منجر به آلودگی DNA در RNA استخراجی شود.
سلولهایی که بصورت شناور رشد میکنند: برای استخراج RNA از این سلول ها، آن ها را به مدت 5 دقیقه درg ×300 سانتریفیوژ کنید. محیط کشت را دور بریزید و سلولها را در PBS سرج مجدداً سوسپانسیون کنید. سلول ها به مدت 5 دقیقه درg ×300 سانتریفیوژ کنید. سپس ®TRIzol را افزوده و با پیپتاژ کردن یا عبور از سرنگ، سلولها را لیز کنید. برای هر ۱۰۶ × 5-10 سلول حیوانی، از 1 میلی لیتر معرف استفاده کنید.
نمونه همگن شده از سلولها را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوباسیون کنید تا تفکیک کامل کمپلکس های نوکلئوپروتئین امکان پذیر شود. سپس برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را برای استخراج RNA به میکروتیوب جدید منتقل کنید.
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
جداسازی فازها برای استخراج RNA
به ازای هر 1 میلی لیتر TRIzol® دو میلی لیتر کلروفرم اضافه کنید. از لوله های در دار استفاده کنید (به دلیل سمیت کلروفرم). نمونه ها را به مدت 15 ثانیه با شدت ورتکس کنید و به مدت 2 تا 3 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. نمونه ها را حداکثر در g× 12000 به مدت 15 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتریفیوژ کنید. پس از سانتریفیوژ به سه لایه تقسیم میشود، لایه پایین تر قرمز رنگ که فنل کلروفرم است، یک فاز میانی و یک فاز آبی در بالا که بی رنگ است. RNA فقط در فاز آبی (رویی) حضور دارد. فاز رویی را با احتیاط و بدون ایجاد ورود به فازهای دیگر، به میکروتیوب جدید منتقل کنید. حجم فاز آبی را اندازه گیری کنید (حجم فاز آبی حدود 60٪ حجم ®TRIzol است که در مرحله اول استفاده شد).
رسوب RNA
با افزودن الکل ایزوپروپیل به فاز آبی، RNA را از فاز آبی رسوب میدهیم. از 0.5 میلی لیتر ایزوپروپیل الکل به ازای هر 1 میلی لیتر ®TRIzol برای همگن سازی اولیه استفاده کنید. نمونه ها را در دمای 15 تا 30 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انکوبه کرده و در حداکثرg × 12000 به مدت 10 دقیقه در دمای 2 تا 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید. رسوب RNA ، که اغلب قبل از سانتریفوژ قابل مشاهده نیست، پس از سانتریفیوژ یک رسوب ژله مانند در کنار و پایین لوله ایجاد می کند.
شست و شوی RNA
برای استخراج RNA بصورت مناسب، مایع رویی را کاملاً بردارید. رسوب RNA را یک بار با 75٪ اتانول بشویید، حداقل 1 میلی لیتر اتانول 75٪ به ازای هر 1 میلی لیتر از ®TRIzol که در مرحله اول استفاده شد، اضافه کنید. نمونه ها را با ورتکس و سانتریفیوژ در حداکثر g × 7،500 به مدت 5 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد مخلوط کنید. این مرحله را یک بار تکرار کنید و تمام اتانول باقیمانده را خارج کنید.
رسوب دوباره RNA
در ادامه مراحل استخراج RNA، رسوب RNA در مجاورت هوا یا با استفاده از خلا به مدت 5-10 دقیقه خشک شود. با استفاده از سانتریفیوژ در خلا خشک نکنید. اجازه ندهید که رسوب RNA کاملاً خشک شود زیرا این امر باعث کاهش حلالیت آن می شود. نمونه های RNA که کم حل شده اند دارای نسبت A260 / A280 <1.6 هستند. با چند بار پیپتینگ محلول RNA آن را در آب DEPC (RNase free) حل کنید .
بررسی خلوص RNA استخراج شده توسط استپکتوفوتومتر
1 میکرولیتر RNA را با 39 میکرولیتر آب DEPC رقیق کنید (رقت 1:40). برای تعیین غلظت و خلوص نمونه، با استفاده از میکرو کووت 10 میکرولیتری، OD را در 260 نانومتر و 280 نانومتر بخوانید. نسبت A260 / A280 باید بالاتر از 1.6 باشد. این قانون را هم اعمال کنید که OD 1 در 260 برابر با 40 میکروگرم در میلی لیتر RNA است. بهتر این هست که غلظت را با دستگاه نانودراپ اندازه بگیرید.
برای مطالعه ی بیشتر در این زمینه به اینجا بروید . همچنین برای دریافت مقاله در همین موضوع نیز می توانید اینجا را بزنید و سپس مقاله را دریافت بفرمایید .
