کشت باکتری های بی هوازی

باکتری های بی هوازی

از نظر آزمایشگاه تشخیص پزشکی، اصلی ترین باکتری های بی هوازی بیماریزا بر اساس محل آنها در بدن متفاوتند. در این مقاله شرکت دانش بنیان پویاژن آزما و آزمایشگاه همکار سازمان غذا و دارو قصد دارد بطور مفصل روش های کشت باکتری های بی هوازی را بررسی کند.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید. 

09101438051
021404436-7

کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

نکات ایمنی کشت باکتری های بی هوازی 


پیروگالول (Pyrogallol) سمی است و امکان جذب از طریق پوست وجود دارد لذا وقتی کریستال های آن را منتقل
می کنید از دستکش و اسپاتول استفاده کنید. %10 NaOH برای پوست سوزش آور است و تنفس آن ممکن است باعث از بین بردن مجاری تنفسی گردد لذا جهت انتقال آن از پیپت با پیپتور یا سمپلر استفاده کنید.

پاکت های تولید کننده گاز مختلفی که مورد استفاده قرار می گیرند و هیدروژن آزاد می کنند سریع با آب واکنش می دهند. جارهای بی هوازی مورد استفاده نباید منفذی داشته و درب آن باید کاملا قابل سیل شدن باشد. پاکت هایی که با آب فعال شده اند اما در جار بی هوازی استفاده نشده اند، باید در زیر هود حدود 30 دقیقه نگهداری گردد تا واکنش آن خاتمه یابد.

مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری های بی هوازی


کشت 48-24 ساعته در محیط مایع Eugon از سودوموناس آئروژینوزا و E. coli، کشت کلستریدیوم اسپوروژنز
در محیط مایع تیوگلیکولات

سه عدد Eugon agar deeps

حمام آب جوش

حمام آب گرم 50-48 درجه سانتی گراد

چهار عدد لوله حاوی محیط مایع تیوگلیکولات

لوپ تلقیح

دو عدد پلیت تریپتیک سوی آگار

چهار عدد پلیت دارای Brewers anaerobic agar 

پوشش های استریل Brewers anaerobic 

گاز پک یک بار مصرف سیستم بی هوازی (BBL)

پاکت های تولید کننده گاز (دیفکو)

Oxrase برای محیط مایع و آگار دار

3 عدد لوله حاوی محیط تریپتیکیز سوی براث دارای ml0/1  اکسیراز برای مایع

3 عدد پلیت حاوی اکسیراز برای آگار

چهار عدد محیط شیبدار تریپتیک سوی آگار

قیچی

درپوش پنبه ای

کریستال پیروگالول(سمی است)

%10 NaOH

لوله های آزمایش

درپوش پلاستیکی

قلم مناسب

دستکش یک بار مصرف

اسپاتول جهت انتقال کریستال های پیروگالول

پیپت یک میلی لیتری با پیپتور (یا سمپلر)

خاک باغچه

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

کاربرد کشت باکتری های بی هوازی در پزشکی

نمونه هایی از این باکتری ها عبارتند از: در خون : باکتریوئیدز فراژیلیس؛

در گوارش:کلستریدیوم ، باکتریوئیدس؛

در سطوح تناسلی: آکتینومیست ، باکتریوئیدس، فوزوباکتریوم، کلستریدیوم، موبیلینکوس؛

و بر روی پوست و بافتهای نرم: کلستریدیوم پرفرینژنس، باکتریوئیدس فراژیلیس، پپتواسترپتوکوکوس.

اصول کشت باکتری های بی هوازی

یکی از فاکتورهای محیطی که باکتری ها و بقیه میکروارگانیزم ها به آن حساس هستند حضور اکسیژن می باشد. به عنوان مثال، بعضی از میکروارگانیزم ها فقط در حضور O2 رشد می کنند و هوازی اجباری نامیده می شوند.

باکتری های بی هوازی اختیاری در حضور یا عدم حضور O2رشد می کنند ولی در حضور O2رشد بهتری دارند. بی هوازی های اجباری مطلق فقط در عدم حضور O2 رشد کرده و در حضور آن آسیب می بینند. بی هوازی های مقاوم به هوا (aerotolerant anaerobes) میکروارگانیزم هایی هستند که نمی توانند از O2استفاده کنند اما بوسیله آن آسیب نمی بینند.

میکروارگانیزم هایی که به مقادیر کم O2 برای رشد نیاز دارند ولی در مقادیر نرمال اکسیژن اتمسفری غیر فعال می شوند میکروآئروفیل نامیده می شوند. این تفاوتها در نیاز به اکسیژن را براحتی می توان با تلقیح یک لوله حاوی محیط مولتن آگار با باکتری مورد بررسی مشاهده کرد. باکتری در قسمتی از محیط که دارای غلظت مناسب O2باشد رشد می کند. در مقالات قبل بطور مفصل درباره بررسی اثر اکسیژن بر رشد باکتری ها پرداختیم.

اکسیژن باکتری

ظاهر کشت عمقی بر روی آگار. هر نقطه نشان دهنده یک عدد کلنی در داخل آگار یا بر روی سطح آگار می باشد.

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

رشد بر روی سطح که تماس مستقیم با اکسیژن اتمسفری دارد، نشان دهنده هوازی بودن است. میزان اکسیژن در داخل محیط با افزایش عمق کاهش یافته تا در ته لوله کاملا بی هوازی می شود. اثرات نابود کنندگی O2در باکتری های بی هوازی باعث ایجاد مشکلاتی در کشت آنها می گردد. در واقع نه تنها باید محیط فاقد O2فراهم کرد بلکه باید میزان مناسب رطوبت برای رشد نیز وجود داشته باشد.

همچنین برای رشد تعدادی از باکتریهای بی هوازی وجود CO2ضروری است. چند روش جهت کشت باکتری های بی هوازی وجود دارد که چهار روش که بیشترین استفاده را دارند توضیح داده می شود.

یکی از مهمترین روشها استفاده از محیط مایع بی هوازی تجاری می باشد. دو عدد از پر مصرفترین این محیط ها، محیط cooked meat و تیوگلیکولات براث است. محیط تیوگلیکولات را می توان با متیلن بلو یا resazurin به عنوان معرف اکسیداسیون-احیا خریداری کرد. وقتی این محیط شروع به آبی یا قرمز شدن کرد، برای کشت باکتری های بی هوازی دارای میزان بالایی اکسیژن بوده و مناسب نیست.

برای باکتری هایی که بی هوازی مطلق نیستند، اگر بر روی محیط شیب دار نوترینت آگار شرایط بی هوازی فراهم گردد، این باکتری ها رشد می کنند.این روش لوله رایت (Wright’s tube) نام دارد که در شکل توضیح داده شده است.

در این روش، شرایط بی هوازی بوسیله پیروگالول و NaOH ایجاد می گردد. در حضور NaOH پیروگالول اکسیده شده و به شدت O2 را حذف می کند. بعد از این که باکتری بر روی سطح شیب دار محیط کشت داده شد، یک در پوش پنبه ای درون لوله قرار داده و دقیقا تا بالای سطح شیب دار محیط انتقال داده می
شود. سپس فضای بین در پوش پنبه ای تا سرلوله بوسیله کریستال های پیروگالول پر شده و  NaOH %10  1ml به آن اضافه می شود. درب لوله با درپوش پلاستیکی محکم بسته شده و فورا لوله بر عکس شده و به همان حالت گرما گذاری می شود.

کشت باکتری های بی هوازی

فراهم کردن لوله کشت بی هوازی . Wrightپیروگالول یک عامل احیا کننده است که بوسیله NaOH فعال شده و اکسیژن را از لوله زدوده و شرایط بی هوازی را فراهم می کند

 

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

باکتری های بی هوازی را می توان بدون استفاده از انکوباتورهای گران قیمت بر روی پلیت های خاص کشت داد. از مهمترین روشهای مورد استفاده، پلیتهای بی هوازی برور (Brewer’s anaerobic petri plate) نام دارد که از یک محیط آگار دار خاص استفاده می کند. پوشش اختصاصی برور به نحوی بر روی پلیت قرار میگیرد که قسمت اعظم سطح محیط را پوشانده و از اکسیژن دور نگهدارد. آگار بی هوازی برور دارای غلظت بالای تیوگلیکولیک اسید است.

گروه های آزاد سولفیدریل تیوگلیکولات، اکسیژن موجود را کاهش داده و در زیر پوشش برور شرایط بی هوازی را ایجاد می کند. روش دیگر کشت باکتریهای بی هوازی استفاده از سیستم بی هوازی گازپک (GasPak) است. در سیستم گازپک بعد از اضافه کردن آب به پاکت گازپک هیدروژن و CO2 آزاد می گردد. یک کاتالیست پالادیوم (pellets) در ظرف در بسته تشکیل آب از هیدروژن و اکسیژن را کاتالیز کرده و در نتیجه اکسیژن از داخل ظرف کاملا بسته حذف می گردد.

پلیت برور

پلیت برور. یک فضای بی هوازی بین پوشش برور و تیوگلیکولات آگار ایجاد می شود.

 

سیستم گازپک

سیستم گازپک

 

جهت آسودگی و وضوح بهتر می توان از کیسه های گازپک به جای ظرف گازپک استفاده کرد. در این روش یک عامل اختصاصی فعال کننده در مجرای مخصوص کیسه ریخته می شود. سپس پلیت تلقیح شده در داخل کیسه گذاشته می شود. با بستن کامل کیسه شرایط بی هوازی بر قرار گردیده و
کیسه در داخل انکوباتور قرار داره می شود. رشد راحت تر مشاهده می گردد.

روش کیسه گازپک

روش کیسه گازپک. (A) یختن مایع فعال کننده گازپک در مجرای کیسه(b) قرار دادن پلیت در داخل کیسه. (C) ایجاد
شرایط بی هوازی با بستن کامل کیسه و انکوباسیون آن

یکی از ساده ترین روشهای کشت بی هوازی اخیرا بوسیله شرکت Oxyrase ابداع شده است. در این روش 0/1ml اکسیراز برای محیط مایع به 5 ml محیط کشت مایع (مولر هینتون،Eugon تریتیکیز سوی، نوترینت ،Schaedler کلمبیا) B.H.I اضافه می گردد. اکثر بی هوازی ها را می توان بلافاصله بعد از اضافه کردن این ماده به محیط تلقیح کرد.

همچنین توسط این شرکت OxyDish و اکسیراز برای آگار ارائه شده است که به راحتی می توان بی هوازی ها را بر روی سطح پلیت کشت و جداسازی کرد. اکسیراز برای آگار با محیط آگار دار به سادگی مخلوط شده و در داخل OxyDish ریخته می شود. OxyDish دارای یک حلقه داخلی است که با سطح آگار کاملا فیکس می گردد و به راحتی شکسته شده و برداشته می شود.

در عرض چند دقیقه، سیستم آنزیمی و سوبسترای اکسیراز برای آگار اکسیژن موجود در محیط آگار دار را کاهش داده و درب پلیت را کاملا محکم می کند. این پلیت می تواند چندین بار باز و بسته شده بدون اینکه شرایط بی هوازی تغییری کند. این روش پیچیدگی و استفاده از دستگاه های گران قیمت را حذف می کند.

روش جدیدتر از اکسیراز برای کشت بی هوازی، OxyPlate می باشد. در این روش پلیت قبلا با فرمولاسیون شبیه محیط کشت بی هوازی تجاری با سیستم آنزیمی اکسیراز پر شده است. آنزیم بطور مداوم اکسیژن داخل محیط و فضای بین در و محیط کشت را کاهش می دهد. چون روش ایجاد شرایط بی هوازی مستقیما در داخل محیط کشت ایجاد می گردد، نیاز به ابزارهای خاص نظیر جار، کیسه و چمبر نیست.

به سادگی بر روی  Oxyplate کشت داده و در شرایط هوازی انکوبه می گردد. مقایسه در کنار هم پلیتهای هوازی و بی هوازی باعث شناسایی کلنی های بی هوازی در همان ابتدا می گردد. پروتکل بطور کامل در مقاله بعدی توضیح داده شده است.

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و مولکولی یعنی انجام دادن تمام تکنیک ها توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051
021404436-7

برای خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه ها و محصولات مولکولی کلیک کنید.

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده، همچنین میتوانید درباره نکات کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی مطالعه کنید و اگر به این مبحث علاقمند هستید میتوانید از این لینک به زبان انگلیسی مطالعه کنید.

همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

منوی دسته بندی های خود را در تنظیمات قالب -> هدر -> منو -> منو موبایل (دسته ها) تنظیم کنید
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
فروشگاه
لیست علاقه مندی ها
0 مورد سبد خرید
حساب من