رنگ آمیزی اسیدفست – آموزشی اصول، نکات و مراحل

اهداف مقاله آموزش رنگ آمیزی اسید فست (Acid fast)

آشناسازی دانشجو با:

1. اساس شیمیایی رنگ آمیزی اسید فست
2. انجام این روش بمنظور تمایز باکتریها به دوگروه مقاوم به اسید وحساس به اسید.

همراه پویاژن آزما باشید…

اصول کلی رنگ آمیزی اسیدفست

عامل بیماری سل یک باکتری از جنس Mycobacteriun است که مهمترین گونه آن باکتری tuberculosis عامل سل است. از گونه های دیگر این جنس M. lepra میباشد که عامل جذام است. این باکتری ها به رنگ آمیزی گرم مقاوم بوده و تنها به روش رنگ آمیزی اسید فست قابل رویت می باشند لذا این روش دارای ارزش تشخیصی است.

خصوصیتی که مایکو باکتریوم را از سایر میکروب ها متمایز میکند حضور لایه های عظیم از چربی در دیواره میباشد که نفوذ رنگ ها را بدرون آن بسیار مشکل می سازد درصدی از رنگ که قادر به نفوذ به درون سلول مایکوباکتریوم ها باشد حتی با عامل های قوی مثل محلول اسید- الکل خارج نمی شود بهمین دلیل اینگونه میکروارگانیسم ها اسید فست (مقاوم به اسید) نامیده میشوند و به سایر میکروارگانیسم ها که براحتی توسط محلول اسید الکل رنگ جذب شده را ازدست می د هند ، غیراسیدفست( حساس به اسید) اطلاق میشود.
دررنگ امیزی اسید فست ( که رنگ امیزی زیل نلسون ziehl-Nelson نیزنامیده میشود) سه معرف بکار می رود.

تصویر باکتری های اسیدفست رنگ آمیزی شده

رنگ اولیه

کربول فوشین

بر خلاف سلول هایی که براحتی توسط رنگ های محلول در آب معمولی رنگ میشوند، مایکوباکتریوم ها با این رنگ ها (نظیرمتیلن بلو وکریستال ویوله) رنگ نمی پذیرند. کربول فوشین یک رنگ قرمز فنولی ا ست که در ترکیبات لپیدی ( که بخش اصلی دیواره مایکوباکتریوم را تشکیل می دهد) محلول است.

بنابراین چنین رنگی درون باکتری نفوذ کرده و باقی می ماند. حرارت باعث افزایش نفوذپذیری این رنگ می شود دراینصورت کربول فوشین از میان چربی دیواره سلول مایکوباکتریوم ها عبورکرده و وارد سیتوپلاسم می شود.

شکل دیگر روش رنگ آمیزی زیل نلسون استفاده ازعوامل مرطوب کننده مثل (turgitol) بجای استفاده از حرارت است که سبب کاهش کشش سطحی بین دیواره سلولی مایکوباکتری ها و رنگ می شود. دراین رنگ آمیزی بدنبال ا ستعمال رنگ اول تمامی سلول ها قرمزمی شوند.

معرف رنگ بر

از اسید الکل ( اتا نل 95% وHcl 3% ) به عنوان معرف رنگ بر در رنگ آمیزی اسیدفست استفاده می شود. دراین پروسه بعد از سرد شدن گسترش، این معرف اضافه میشود. سرد شدن سبب سخت شدن ترکیبات واکسی (چربی )سلول می گردد. بدنبال استفاده از این معرف، سلول های اسیدفست نسبت به رنگبری مقاومت نشان می دهند زیرا رنگ اولیه در ترکیبات چربی سلول قابلیت انحلال بیشتری نسبت به عوامل رنگبر دارد. بنابراین رنگ اولیه در سلول مایکوباکتریوم ها باقی می ماند واین سلولها برنگ قرمزدرمی آیند. سلول های غیر اسیدفست که فاقد ترکیبات چربی هستند بسرعت در طی رنگبری رنگ خودرا ازدست داده و بی رنگ می شوند.

رنگ متضاد

متیلن بلو

چون سلول های غیراسید فست توسط معرف رنگبر فاقد رنگ شده اند قادر به جذب رنگ دوم خواهند بود و به رنگ آبی در می آیند در حالیکه اسیدفست ها به همان رنگ اولیه باقی می مانند.

موادموردنیاز برای رنگ آمیزی اسیدفست

کشت

کشت 24 یا 48 ساعته از مایکوباکتریوم(یا واکسن سل آماده) وS. aureus

معرف ها

کربول فوشین(carbol fuchsin ) . ا سید الکل و متیلن بلو

وسایل مورد نیاز

شعله چراغ ؛Hot plate؛ لوپ تلقیح؛ لامهای شیشه ای ، کاغذ خشک کن، کاغذ عدسی ، سینی رنگ آمیزی ومیکروسکپ

روش رنگ آمیزی اسیدفست

1. تهیه گسترش( مخلوط دو باکتری)
2. خشک شدن درمجاورت هوا
3. فیکسا سیون توسط حرارت
4. سطح گسترش را کاملا با کربول فوشین بپوشانید وآنرا روی یک صفحه داغ قرار دهید(به جای Hot plate از شعلة گاز نیز می توان استفاده کرد) بگذارید این رنگ بمدت 5 دقیقه بخارکند(a)

پروتکل رنگ آمیزی اسیدفست

نکات مورد توجه

1. ازخشک شدن رنگ جلوگیری کنید. برای این منظور درصورت نیاز به لام رنگ اضافه کنید.
2. ازجوشیدن رنگ جلوگیری کنید.
3. بگذارید لام سرد شود.
4. لام را با آب بشویید(b).
5. محلول رنگ بر ا سید الکل را بصورت قطره قطره روی گسترش بریزید تا آ خرین قطره قرمز رنگ نیز آرام خارج شود(c).
6. شستشوی لام با جریان ملایم آب(d)
7. افزودن متیلن بلو بمدت 2 دقیقه (e)
8. شستشوی لام با آب (f)
9. خشکاندن گسترش با کاغذ خشک کن (g)و مشاهده میکروسکپی ( عدسیx 100 )

خلاصه پروتکل رنگ آمیزی اسیدفست

مشاهدات و نتایج رنگ آمیزی اسیدفست

بعد ازمشاهده تمام قسمت های گسترش با عدسی 100، نتایج خودرا ثبت کنید.

1. یک میدان دید هریک از این گسترشها را نقاشی کنید.
2. سلولها را بر اساس شکل و تر تیب قرارگیری آنها توضیح دهید.
3. رنگ سلولهای رنگ آمیزی شده را بیان کنید.
4. میکروب ها را بر اساس واکنش ایجاد شده تقسیم بندی کنید (اسید فست – غیر اسید فست )

مایکوباکتریوم رنگ شده با روش زیل نلسون. مایکوباکتریوم بصورت میله ای قرمز رنگ مشاهده می شود