برای بررسی بیان ژنهای خاص در یک نمونه و بررسی حضور ژن موردنظر مثلا تشخیص بیماری با بیومارکرهای اختصاصی پس از استخراج RNA از نمونه موردنظر باید تست ریل تایم RealTime-PCR انجام شود. اما RNA پایداری مناسبی برای این تست ندارد .پس لازم است ابتدا آن را به cDNA یا complementary DNA تبدیل کنیم. این کار با استفاده از آنزیم ریورس ترنسکریپتاز در دستگاه ترموسایکلر، طبق ویدئو انجام میشود.
برای انجام تست cDNA ابتدا لازم است RNA نمونه مورد نظر را استخراج کنید. برای اینکار میتوانید آموزش استخراج RNA با ترایزول را از اینجا مشاهده کنید. بر اساس هدفی که از انجام تست دارید سه نوع پرایمر را می توانید انتخاب کنید. این سه نوع شامل : اولیگو dT، رندوم هگزامر و پرایمر اختصاصی می شود.
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
همانطور که می دانید mRNA در انتهای خود دارای دم پلی A میباشد. در نتیجه وقتی شما می خواهید فقط mRNA را بررسی کنید کافیست از پرایمر اولیگو dT استفاده کنید. اما توجه کنید که میزان cDNA در نهایت کم خواهد بود. برای افزایش این مقدار و هنگامی که mRNA مدنظر شما نیست و یا نمونه یوکاریوتی نیست می توانید از رندوم هگزامر استفاده کنید که ۶ نوکلئوتید رندوم هستند و به هر بخشی از هر RNA می توانند متصل شده و همچنین مانع از ایجاد ساختارهای ثانویه نیز می شوند.
رندم هگزامرها و پرایمر الیگو dT
اما می توان ویژگی های مثبت این دو پرایمر را مخلوط کرده و از پرایمر اختصاصی استفاده کرد. در این حالت توالی RNA مورد نظر شما سنتز می شود ولی کارایی و میزان cDNA بسیار کم خواهد بود.
پرایمر اختصاصی
معمولا در کیت های رایج موجود در بازار در ابتدا پس از افزودن RNA و پرایمر به میکروتیوب باید حدود ۵ دقیقه در دمای ۷۰ درجه باقی بماند تا ساختارهای ثانویه RNAها باز شده و خطی شوند. پس از آن آنزیم، بافر آن و آب مقطر اضافه شده و داخل دستگاه قرار می گیرد و ابتدا در دمای اتصال پرایمرها متصل شده و پس از یک ساعت در دمای اپتیموم آنزیم، میزان مناسبی از cDNA خواهیم داشت.
مراحل سنتز cDNA با استفاده از پرایمر الیگو dT
