اهداف و مراحل مهندسی ژنتیک ( قبل تر بصورت کلی توضیح داده شد. در این مقاله قصد داریم آخرین مرحله از کلونینگ ژن را بطور دقیق بررسی کنیم. در این مرحله میخواهیم کلونی هایی که حامل پلاسمید نوترکیب (پلاسمید حاوی ژن موردنظر) هستند را شناسایی کنیم.
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن
- استخراج پلاسمید و ژن که میتوانید از انواع کیت استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید و الکتروفورز
- دایجستشن با آنزیم های محدود کننده و الکتروفورز
- لایگیشن (ligation)
- ترنسفورم به باکتری میزبان و کشت باکتریها (transform)
- انتخاب کلونی (colony selection)
- کشت باکتری برای تولید پروتئین موردنیاز
- تخلیص پروتئین
نکته: دقت کنید که برای اطمینان از صحت انجام کلونینگ ژن مراحل مختلف باید هر مرحله استخراج، PCR، الکتروفورز و برای اطمینان کامل تعیین سکانس ژن موردنظر انجام شود.
مرحله انتخاب کلونی
پس از آنکه شما پلاسمید ها را به درون باکتری های مستعد شده فرستادید حالا باید باکتری ها را کشت دهید تا بتوانید از آنها استفاده کنید. اما ژن هایی که ما وارد باکتری ها کردید چند نوع میتوانند باشند:
- پلاسمید هایی بدون ژن خارجی (هنگام لایگیشن دو انتهای خود پلاسمید به هم متصل شده)
- ژن ها به تنهایی
- پلاسمیدهایی که حامل ژن خارجی هستند
برای تایید حضور پلاسمید درون باکتری از مارکر آنتی بیوتیک استفاده میکنیم. هر پلاسمید مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک ایجاد میکند. با افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت، باکتری های حامل پلاسمید در آن رشد می کنند. اما در اینجا ما به باکتری هایی نیاز داریم که پلاسمید حامل ژن خارجی (پلاسمید نوترکیب) را حمل می کنند. برای اینکار روش های متفاوتی وجود دارد که رایج ترین آن کلونی آبی و سفید است. این روش بسیار قابل اطمینان است و با استفاده از عملکرد آنزیم بتا گالاکتوزیداز در اوپران لک (lac operon) که لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تجزیه میکند.
حضور لاکتوز در محیط کشت باعث فعال شدن ژن های آن میشود. بیشتر پلاسمیدهایی که برای مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن استفاده می شوند حامل قسمتی از این اپران یعنی ژن LacZ هستند . این ژن آنزیم بتاگالاکتوزیداز را تولید میکند. با تغییراتی در این ژن جایگاه برش بسیاری از آنزیم های محدود کننده وجود دارد (multiple cloning site (MCS)) تا شما بتوانید ژن خارجی را درون آن قرار دهید و این ژن را غیرفعال کنید و دیگر در حضور لاکتوز آنزیم فعالی تولید نمیشود. درحالیکه پلاسمیدهایی که نوترکیب نیستند آنزیم را بصورت فعال تولید کرده و لاکتوز را تجزیه میکنند.
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
کلونی آبی و سفید چگونه ایجاد می شود؟
برای شناسایی کلونی هایی که حاوی پلاسمید نوترکیب هستند از یک سوبسترای رنگی به نام X-gal بجای لاکتوز استفاده میکنیم و آن را به پلیت آگار اضافه میکنیم. این ماده از هیدرولیز 5-bromo-4-chloro-indoxyl بدست آمده که وقتی تجزیه شود ماده ای آبی رنگ به نام 5,5’-dibromo-4,4’-dichloro-indigo رسوب میکند. این ماده ساختاری شبیه لاکتوز دارد و آنزیم بتاگالاکتوزیداز آن را تجزیه میکند. درنتیجه باکتری هایی که حامل پلاسمید غیرنوترکیب هستند این ماده را تجزیه کرده و کلونی های آبی ایجاد میکنند درحالیکه باکتری هایی که حامل پلاسمید نوترکیب هستند نمی توانند آن را تجزیه کرده و کلونی های بی رنگ یا سفید ایجاد می شود.
همچنین درکنار X-gal از Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) نیز استفاده میشود که آنالوگ غیرمتابولیزه گالاکتوز است و باعث فعال شدن بیان ژن lacZ میشود. دقت کنید که IPTG سوبسترای ژن بتاگالاکتوزیداز نیست و فقط محرک آن است.
تصویری از یک پلاسمید وکتور حامل ژن مقاومت به آنتی بیوتیک و lacZ که جایگاه برش چندین آنزیم محدودکننده را دارد.
مراحل انجام انتخاب کلونی در مهندسی ژنتیک چگونه است؟
برای این کار تنها کافی است پس از ترنسفورم کردن که در مقاله قبل توضیح دادیم، باکتری ها را روی محیط کشت آگار حاوی آنتی بیوتیک، X-gal و IPTG کشت دهید. کلونی های سفید همگی حامل ژن هستند. برای اطمینان صد درصدی از وجود ژن اختصاصی خود درون این باکتری ها، پس از رشد میتوانید با پرایمر های ژن اختصاصی خود، روی یکی از کلونی ها، کلونی PCR انجام دهید که در مقالات آینده توضیح خواهیم داد و سپس آن را تعیین سکانس کنید.
تصویری شماتیک از پروسه انتخاب کلونی
مرحله آخر
حالا می توانید کلونی ها را برای نگهداری ژن استوک بگیرید تا برای مدت طولانی حفظ کنید . برای تولید یک پروتئین نوترکیب آن را پس از کلون وارد میزبانی برای تولید پروتئین کرده و یا درون همان باکتری پروتئین های تولیدی را بررسی کرده و پس از اطمینان توسط SDS-PAGE و وسترن بلات برای تولید انبوه از آن میزبان استفاده کنید.
تصویری از یک پلیت آگار که کلونی های آبی و سفید روی آن رشد کرده. کلونی های سفید باکتری های حامل پلاسمید نوترکیب هستند.
