ترابلشوتینگ استخراج ژنوم از باکتری
اگر تمامی مراحل استخراج را طبق پروتکل موجود در کیت انجام دهید، نتیجه قابل قبولی خواهید داشت و DNA با کیفیتی به دست خواهید آورد. اما اگر اولین باری باشد که این آزمایش را انجام می دهید و مخصوصا اگر جز دانشجویان تازه کار باشید، مطلب مربوط به ترابلشوتینگ استخراج DNA از باکتری بسیار به کار شما خواهد آمد. در این مطلب قصد داریم به شما بگوییم در حین پروسه استخراج ممکن است با چه چالش هایی روبرو شوید و در صورت مواجه شدن چگونه هر کدام از آن ها را رفع کنید.
حتما DNA استخراجی را بررسی کنید
اولین کاری که پس از استخراج DNA انجام می دهید، بررسی کیفیت و غلظت آن از طریق الکتروفورز یا نانودراپ است؛ اگر جذب DNA را با نانودراپ می خوانید در نظر بگیرید که OD حدود 1 غلظت 50 نانوگرم بر میکرولیتر را نشان می دهد (البته این مساله بستگی زیادی به هدف بعدی شما از استخراج DNA می باشد. مثلا اگر هدف شما PCR است با مقدار خیلی کم DNA هم می توانید PCR را انجام دهید). مساله بعدی نسبت خوانش طول موج 260 به 280 می باشد. این نسبت معمولا باید بیشتر از 1.8 باشد. در واقع جذب 280 میزان پروتئین موجود در نمونه و جذب 260 غلظت DNA را می خواند. نسبت این دو هر چه بیشتر باشد نشان دهنده خلوص بیشتر DNA استخراجی است.
در نظر داشته باشید که جذب بسیار بالا همیشه نشانه خوبی نیست؛ گاهی بالا بودن بیش از حد جذب DNA نشان دهنده وجود اسمیر است.
البته به دلیل حساسیت بسیار بالای دستگاه نانودراپ، نیازمند کالیبراسیون با فاصله زمانی کم بوده و معمولا در صورت عدم کالیبراسیون به موقع خطای زیادی خواهد داشت. در صورت در دسترس نبودن دستگاه نانودراپ بهتر است 5 میکرولیتر از DNA استخراجی را روی ژل آگارز ران کنید.
به دلیل سنگین بودن باند ژنوم، بهتر است از ژل با درصد پایین تر از 1% استفاده کنید. به یاد داشته باشید که به هیچ وجه اندازه ژنوم را نمی توانید اندازه بگیرید اما خلوص، کیفیت و غلظت تقریبی را می توان با این روش مشاهده کرد. باند موجود در ژل آگارز باید خطی، بدون وجود اسمیر و بدون وجود RNA باشد. ضمنا در صورتی که چاهک ژل نیز از خود رنگ متصاعد می کند می تواند نشان دهنده وجود ناخالصی مثل پروتئین یا وجود الکل و سایر موارد ناخواسته در نمونه باشد.
در ادامه چندین مورد از خطاهایی که ممکن است حین انجام استخراج ژنوم با ان مواجه شوید را نام می بریم و راه های رفع این موانع را تا حد ممکن برای شما توضیح خواهیم داد. اگر دوست دارید این تکنیک را در کنار کارشناسان ما به صورت عملی خودتان انجام دهید می توانید در دوره های کارآموزی PCR شرکت کنید. برای اطلاعات بیشتر با ما در تماس باشید.
1.عدم مشاهده باند
اگر هیچ گونه باندی بر روی ژل آگارز نبینید، می تواند نشان دهنده عدم استخراج ژنوم باشد. البته همیشه این گونه نیست! به عنوان مثال در صورت استخراج ژنوم از یک تک کلنی (مثلا برای آزمایشاتی نظیر تعیین سکانس) یا از نمونه های گرفته شده از محیط بدون کشت دادن به علت پایین بودن غلظت باکتری استفاده شده غلظت DNA نیز کم خواهد شد و در مواردی هیچ باندی مشاهده نمی شود. در این صورت توصیه می شود که واکنش PCR را با همین template انجام دهید و میزان نمونه را در واکنش PCR بیشتر در نظر بگیرید و اضافه کنید.
اما اگر واقعا موفق به استخراج هیچ گونه نمونه ای نشده اید موارد زیر را در نظر بگیرید:
1-1 تمامی مراحل را چک کنید
گاهی یک خطای کوچک، مثل اشتباه ریختن بافرها یا جا انداختن یک مرحله می تواند باعث از دست رفتن محصول نهایی شود. اگر اولین دفعاتی است که استخراج را انجام می دهید سعی کنید این کار را تحت نظر یک فرد با تجربه تر انجام داده و اگر تنها هستید، هر مرحله را قبل و پس از انجام با پروتکل چک کنید تا مرحله ای جابه جا نشده یا جا نماند.
2-1 باکتری خود را بشناسید
قبل از شروع کار حتما یک لام از نمونه بگیرید و با رنگ آمیزی گرم نوع باکتری را تعیین کنید. در صورت جداسازی ژنوم از نمونه گرم مثبت حتما مرحله انکوباسیون در 37 درجه را انجام دهید تا در این مدت دیواره باکتری به خوبی لیز شود.
3-1 در هنگام خروج الکل مراقب باشید
در مراحل پایانی استخراج نیاز به خارج کردن الکل از درون میکروتیوب دارید. مراقب باشید چون رسوب DNA بسیار کوچک است و در صورت بی دقتی ممکن است این رسوب را به همراه الکل از داخل میکروتیوب خارج کنید. همچنین در صورت برعکس کردن تیوب بر روی دستمال کاغذی نیز مراقب باشید رسوب از ته میکروتیوب کنده نشده و بیرون نریزد.
شکل 1- در چاهک نمونه 1 و 2 هیچ ژنومی مشاهده نمی شود. نمونه 3 دارای ژنوم می باشد.
2.مشاهده اسمیر
پس از افزودن اولین بافر و پیپتاژ و ورتکس کردن محلول به اندازه کافی جهت تخریب دیواره سلولی باکتری، مواد داخل سلولی به بیرون می ریزد؛ DNA نیز در این محلول موجود است. به علت حساس بودن ملکول DNA اگر در مراحل بعدی استخراج از پیپتاژ، ورتکس یا هر گونه برخورد شدیدی با میکروتیوب استفاده کنید، احتمال خورد شدن ملکول DNA وجود داشته و در الکتروفورز اسمیر(یا با نانودراپ جذب خیلی بالا) خواهید داشت. پس حتی الامکان سعی کنید طبق پروتکل پس از افزودن بافر 2 به محلول، فقط با Invert کردن کار مخلوط کردن بافرها را انجام دهید و از انجام هر گونه برخورد شدیدی با میکروتیوب حاوی DNA پرهیز کنید.
شکل 2- در نمونه شماره 1 و 2 استخراج به خوبی انجام شده است. اما در نمونه 3 و4 باندهای اسمیر مشاهده می شود.
3.مشاهده باند RNA
اولین کاری که پس از باز کردن درب جعبه کیت انجام می دهید، اضافه کردن کل محتویات میکروتیوب حاوی RNase به داخل بافر 1 است. به یاد داشته باشید پس از افزودن آن، همواره بافر 1 را درون یخچال قرار دهید و در زمان استفاده نیز زمان زیادی در معرض دمای اتاق قرار ندهید. آنزیم RNase در دمای اتاق فعال شده و کم کم کارایی خود را از دست می دهد؛ در نتیجه در صورت درست عمل نکردن این آنزیم باند اسمیر مانندی را در انتهای ران ژل مشاهده خواهید کرد.
شکل 3- در صورت عمل نکردن آنزیم RNase باند محوی در انتهای ژل مشاهده خواهد شد.
4. مشاهده باند خیلی ضعیف
دلایل مختلفی برای پایین آمدن بازده استخراج وجود دارد. مطمئن باشید اگر تمامی مراحل را طبق پروتکل انجام دهید DNA با کیفیت خوب خواهید داشت.
1-4 مقدار کافی سلول بردارید
شما می توانید از مقادیر بسیار کم باکتری نیز برای استخراج استفاده کنید اما اگر نیاز به غلظت بالایی از DNA خود دارید به یاد داشته باشید که بهترین حالت استخراج، استخراج از کشت مایعی است که حدود 12-18 ساعت انکوبه شده باشد و دارای OD بیشتر از 0.6 باشد. اگر کشت مایع شما به خوبی رشد نکرده و به اصطلاح کدورت زیادی ندارد، نمی توانید توقع کیفیت بالایی از استخراج خود داشته باشید. در صورت استخراج از روی پلیت نیز به یاد داشته باشید که مقدار مناسبی از سلول ها را بردارید.
2-4 همیشه بیشتر بهتر نیست
با دیدن مورد قبلی شاید به این فکر افتاده باشید که با برداشتن مقدار زیادی از کشت مایع و تعداد زیادی لوپ از کشت آگار، بازده بالاتری نیز خواهید داشت. باید بگوییم که این تصور اشتباه است و مقادیر تعیین شده برای هر بافر به اندازه رسوب 3 تا 5 میلی لیتر از کشت مایع تعیین شده است. یعنی با برداشتن مقدار بیشتر نتیجه بهتری نخواهید گرفت. چه بسا با برداشتن مقدار بیش از حد سلول، ناخالصی ها و مواد سلولی بیشتری نیز وارد محلول خواهید کرد که در مراحل بعدی کار اختلال ایجاد خواهد کرد. پس همیشه مقدار مناسب تعیین شده در کیت را بردارید.
3-4 مراحل را با دقت انجام دهید
گاهی بی دقتی های کوچک در حین پروسه کار می تواند روی نتیجه نهایی تاثیر زیادی بگذارد؛ حتی اگر دفعات زیادی استخراج را انجام داده اید، باز هم در حین انجام کار سعی کنید بروشور را در دسترس خود قرار داده و مراحل را قبل و بعد از انجام هر بار چک کنید.
شکل 4- نمونه استخراج ضعیف را در باند شماره 4 می توانید مشاهده کنید.
5 چاهک دارای باند است
گاهی پیش می آید که پس از انجام ران الکتروفورز و تماشای عکس آن احساس می کنید مقداری DNA داخل چاهک باقی مانده و هر چه میزان ران را ادامه می دهید خارج نمی شود. آن انعکاس نوری که می بینید در واقع باند ژنوم نیست؛ بلکه ناخالصی های موجود در ویال استخراج شما است که درون جاهک باقی مانده و با جریان الکتریسیته حرکت نمی کند. هر چه مراحل جداسازی پروتئین و سایر باقی مانده های اجزای سلولی را بهتر و دقیق تر انجام دهید، استخراج خالص تری خواهید داشت و در نتیجه در مراحل بعدی مانند PCR این بازده بهتری خواهید گرفت. به عنوان مثال پس از افزودن بافر X و سانتریفیوژ، زمانی که محلول رویی را از رسوب جدا کرده و به میکروتیوب جدید منتقل می کنید، دقت داشته باشید که هیچ ذراتی به همراه محلول وارد میکروتیوب جدید نشود. در غیر این صورت یک بار دیگر سانتریفیوژ انجام داده و دوباره ویال را تغییر دهید تا محلول شفافی به دست آید.
شکل 5- همانطور که مشخص است در نمونه شمار ه 1 چاهک نور UV را بازتاب داده و اصطلاحا رنگ دارد.
امیدواریم این مقاله به شما در استخراج ژنوم با کیت پویاژن آزما کمک کننده باشد؛ اگر از مشتری های ما هستید می توانید در صورت داشتن سوال در مورد هر مرحله ای، با شماره های ما تماس بگیرید. همکاران ما شما را راهنمایی خواهند کرد.
