برای بررسی حضور یک ژن خاص در نمونه و یا اندازه گیری میزان بیان یک ژن بصورت کمی از ریل تایم RT-PCR استفاده می کنیم. می توانیم با استفاده پرایمرهای مرتبط با یک بیومارکر اختصاصی و طراحی پروب، یک بیماری را تشیص دهیم .
ابتدا برای جدا شدن دو رشته DNA یا cDNA باید دما بالا برود (مانند PCR معمولی) . سپس در دمای اتصال (Annealing) پرایمر ها و پروب که بصورتی طراحی شده تا بین دو پرایمر قرار بگیرد، به ژن مورد نظر متصل می شوند .
پروب به فلورسنت و کوئنچر آن متصل شده
توالی پروب به این صورت است که یکی از نوکلئوتیدها به یک فلورسنت متصل شده است و نوکلئوتید انتهای مخالف آن به کوئنچر آن فلورسنت متصل شده تا مانع از ساتع شدن نور فلورسنت شود . دستگاه وارد مرحله ی طویل سازی (extension) می شود . با این اتفاق ، آنزیم پلیمراز توالی را در ادامه ی پرایمر ها می سازد . سپس به توالی پروب که می رسد نوکلئوتیدهای آن را یکی یکی بر می دارد و نوکلئوتید جدید می گذارد . درنتیجه ، فلورسنت از کوئنچر خود دور شده و نور ساتع می کند . حالا دستگاه نور ساتع شده را دریافت می کند.
فلورسنت دور از کوئنچر از خود نور ساتع میکند
هرچه نور ساتع شده بیشتر شود نمودار دستگاه بالاتر می رود . این نمودار میزان نور فلورسنت بر اساس سیکل را نشان می دهد . هر نمونه ای که نمودار آن در سیکل کمتر (زودتر) بالا بیاید یعنی میزان بیان بیشتری دارد . از آنجا که شما در لحظه، پس از چند دقیقه با بالا آمدن نمودار متوجه حضور ژن خود می شوید و حتی میزان هر ژن را در هر نمونه (بصورت کیفی) میتوان در طول انجام تست متوجه شد ، به آن Real time می گویند . برای خواندن یک مقاله در همین زمینه به اینجا بروید .
نمودار Amplification در RT-PCR
امیدواریم از مقاله RT-PCR توسط پویاژن آزما بهره برده باشید
