تعدادی از باکتری ها آنزیم هایی به نام هیدرولاز تولید می کنند. هیدرولازها، شکسته شدن مولکول های آلی را به مولکول های کوچک تر در حضور آب، کاتالیز می کنند. این آزمایش، هیدرولیز نشاسته را ارائه می دهد. شرکت دانش بنیان و آزمایشگاه همکار پویاژن آزما قصد دارد در این مقاله به بررسی تست هیدرولیز نشاسته بپردازد.
مواد مورد نیاز برای انجام تست هیدرولیز نشاسته
- کشت 48-24 ساعته از E. coli، باسیلوس سوبتیلیس و پروتئوس ولگاریس بر روی محیط TSA
- یک پلیت نشاسته آگار
- ید رنگ گرم ( 011 ml ،4gr KI ،0gr I2آب مقطر)
- قلم مناسب
- لوپ تلقیح
- شعله
- پیپت پاستور با پیپتور یا سمپلر
- انکوباتور تنظیم شده در 35 درجه
مواردی که در تست هیدرولیز نشاسته یاد میگیرید
- درک بیوشیمیایی هیدرولیز نشاسته
- انجام آزمایش هیدرولیز نشاسته
مولکول نشاسته از دو جزء تشکیل شده است: آمیلوز که یک پلیمر گلوکز بدون انشعاب 300-200 واحدی می باشد و آمیلوپکتین که یک پلیمر شاخه دار بزرگ است. هر دو بوسیله باکتری های معین با استفاده از آمیلاز بسرعت هیدرولیز شده و دکسترین، مالتوز و گلوکز بصورت زیر تولید می گردد:
رنگ گرم می تواند جهت نشان دادن وجود نشاسته مورد استفاده قرار گیرد. وقتی این ماده با نشاسته تماس برقرار می کند کمپلکس آبی تا قهوه ای ایجاد می کند. نشاسته هیدرولیز شده نمی تواند تغییر رنگ ایجاد کند. در صورتیکه بعد از اضافه کردن ید یک محدوده شفافی بر روی محیط حاوی نشاسته و باکتری رشد کرده ایجاد گردد، آلفا آمیلاز بوسیله باکتری تولید شده است. اگر هیچ شفافیتی ایجاد نگردید، نشاسته هیدرولیز نشده است.
آزمایش هیدرولیز نشاسته با اضافه کردن ید. (a,c) هیدرولیز مثبت. شکست کامل تمام نشاسته بوسیله ایجاد هاله شفاف نشان داده شده است. (b) نشاسته دست نخورده باقی مانده است که بوسیله ایجاد رنگ قهوه ای ارغوانی در اطراف محل کشت داده شده مشخص شده است.
پروتکل بررسی هیدرولیز نشاسته
مرحله اول: آزمایش هیدرولیز نشاسته
1- بوسیله قلم مناسب پشت یک پلیت نشاسته آگار را مانند شکل به سه قسمت تقسیم کنید. هر قسمت را با باکتری که قرار است کشت شود علامت گذاری کنید. نام خود و تاریخ را نیز اضافه کنید.
2- بصورت استریل هر باکتری را در قسمت مربوطه بصورت یک خط کشت دهید.
3- پلیت را در 35 درجه به مدت 48-24 ساعت انکوبه کنید.
مرحله دوم
- چند قطره از ید را در هر طرف خط کشت داده شده بریزید. اگر هاله شفاف در اطراف باکتری رشد کرده ایجاد گردید، نشاسته هیدرلیز شده و آزمایش مثبت است. اگر هاله شفاف ایجاد نگردید یا محیط آبی گردید، نشاسته هیدرولیز نشده و آزمایش منفی است.
- اگر خواندن نتایج مشکل است، روش آلترناتیو این است که درب پلیت را برداشته و آن را بطور برعکس بر بالای ظرف حاوی کریستال های ید قرار دهید. بخار آزاد شده ید با نشاسته واکنش می دهد بدون آنکه با رنگ قرمز قهوه ای تداخل ایجاد کند.
- نتایج را یادداشت کنید.
تذکرات لازم
- در ابتدا با احتیاط چند قطره ید را به یک انتهای خط کشت داده شده اضافه کنید که در این صورت بقیه پلیت آلوده نشده و در صورت ضرورت می توان مجددا انکوبه و سپس آزمایش را تکرار کرد.
- به محض اضافه کردن ید ایجاد یا عدم ایجاد رنگ آبی را یادداشت کنید.
- باکتریهایی که یک رنگ قرمز – بنفش ایجاد کنند (هیدرولیز ناقص) باید بعد از انکوباسیون بیشتر مجددا تست گردند.
