در این مقاله از پویاژن میخواهیم به سوالات متداول مرحله لایگیشن بپردازیم .
برای مشاوره و کارآموزی برای مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن میتوانید با ما تماس بگیرید
09101438051
02140443676-7
اصول مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن را در مقالات قبل توضیح دادیم . این قسمت را می خواهیم به سوالات متداول راجع به مرحله لایگیشن اختصاص دهیم . برای مطالعه بیشتر: آموزش کلونینگ ژن – مرحله لایگیشن
برای انجام لایگیشن به چه نمونه هایی برای کنترل نیاز دارم؟
برای انجام لایگیشن باید حتما یک کنترل پلازمید تنها + لیگاز داشته باشید. این به شما اطمینان میدهد که دایجست و لایگیت کامل انجام شده و اگر با فسفاتاز تیمار کرده بودید این تیمار به خوبی انجام شده یا نه.
وقتی آن را کشت میدهید و با رشد کردن در محیط آنتی بیوتیک دار مطمئن میشوید که ترنسفورم و لایگیشن به خوبی انجام شده است (اطلاعات بیشتر در بخش انتخاب کلونی که به زودی توسط تیم پویاژن آزما منتشر خواهد شد).
اما برای ترابل شوتینگ و بررسی خطاهای احتمالی میتوانید این کنترل ها را نیز داشته باشید:
- وکتور برش نخورده بدون لیگاز، برای بررسی قابلیت رشد سلولهای مستعد شده . (مطالعه در بخش ترنسفورم که به زودی منتشر خواهد شد) و تایید قابلیت مقاوت به آنتی بیوتیک پلاسمید.
- وکتور برش خورده بدون لیگاز، عدم رشد در نتیجه اطمینان از صحت دایجست و صحت لایگیشن در صورت رشد وکتور برش خورده با لیگاز
- ژن الحاقی یا آب، به عنوان کنترل منفی عمل میکند و اگر یک کلنی هم در ترنسفورم این نمونه رشد کند به معنای آلوده بودن لیگاز یا یکی از مواد به پلازمید است.
میزان وکتور ژن الحاقی و نسبت آنها در لایگیشن را چگونه بفهمم؟
معمولا نسبت 3 به یک برای ژن و وکتور (ژن 3 برابر وکتور) مناسب است. اما میتوانید اگر لایگیشن شما با این نسبت عمل نکرد و یا کلونی های پیچیده ای داشتید، برای لایگیشن بهتر و مناسب این نسبت را اپتیمایز کنید. اگر نسبت 3 به یک به شما میانگین سایز ژن و پلازمید را داد این به مولاریته ی انتهای آزاد DNA موجود و در دسترس برای لیگاز مرتبط است.
بطور ساده دو انتها برای هر DNA با هر اندازه ای وجود دارد، برای لایگیشن بهتر در انتهای چسبنده شما برای هر ژن الحاقی باید 3 انتها برای هر انتهای در دسترس وکتور در نظر بگیرید (و برای انتهای صاف میزان بیشتری در نظر بگیرید) . شما میتوانید به راحتی از سایت اندازه گیری لایگیشن استفاده کنید.
