وسترن بلات

تکنیک وسترن بلات یا ایمونوبلاتینگ یک روش آزمایشگاهی است که با استفاده از آنتی بادی ها، پروتئین های خاص را از مخلوط های پروتئینی شناسایی و تعیین مقدار می کند. این روش در زمینه های مختلف بیولوژی مولکولی، بیوشیمی، ایمنولوژی و پزشکی کاربرد دارد. برای مثال، با استفاده از تکنیک وسترن بلات می توان حضور و مقدار پروتئین های ناشی از ژن های کلون شده، پروتئین های تغییر یافته پس از ترجمه، پروتئین های آلوده به ویروس یا پروتئین های ناشی از برخورد با عامل های فعال کننده را مشخص کرد. در این مقاله با پویاژن آزما همراه باشید تا این تکنیک را به طور مفصل شرح بدهیم.

مراحل وسترن بلات

برای اجرای تکنیک وسترن بلات، لازم است چند مرحله را طی کرد. در ابتدا، نمونه های حاوی پروتئین با استفاده از محلول های شوینده آماده سازی می شوند. محلول های شوینده حاوي تركيباتي هستند كه قادر به حل كردن پروتئين ها و كسب كردن يك حالت يك دست و مناسب براي الكتروفورز هستند. مثلاً ، يكي از محلول هاي شوينده رايج سديم دودسيل سولفات (SDS) است كه يك دترجنت قوي است و قادر به حل كردن پروتئين ها با ساختار هاي مختلف است. SDS باعث مي شود كه پروتئين ها به صورت خطي شده و يك بار منفي يكسان دريافت كنند. در نتیجه پروتئين ها فقط براساس سايز و وزن مولكولي جداسازي شوند و نه براساس شكل يا بار خود.

سپس، پروتئین ها با استفاده از الکتروفورز در ژل جداسازی می شوند. تکنیک الکتروفورز پروتئین را می توانید به طور کامل در این مقاله بخوانید. اما به طور خلاصه می توان گفت که الكتروفورز يك روش فيزيكي است كه با استفاده از يك فيلد الكتريكي ، مولكول هاي داراي بار را در يك محيط جامد يا مايع حركت داده و جداسازي مي كند. در تكنيك وسترن بلات ، پروتئين ها در يك ژل پلي آكريل آميد (SDS-PAGE) قرار داده شده و با توجه به سايز و وزن مولكولي آنها جابجا مي شوند. پروتئين هاي كوچك تر سريع تر و پروتئين هاي بزرگ تر كندتر حركت كرده و به سمت قطب مثبت  رفته؛ در نهايت ، يك الگوي نواري از پروتئين ها در ژل ديده مي شود.

پس از الکتروفورز، پروتئین های جداسازی شده به یک غشاء منتقل می شوند. غشاء معمولاً از نیتروسلولز یا پلی وینیلیدن فلوراید (PVDF) ساخته شده است. این غشاء ها دارای خواصی هستند که باعث می شوند پروتئین ها به آنها بچسبند و از روی آنها جدا نشوند. انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء با استفاده از یک جریان الکتریکی صورت می گیرد. در این مرحله، پروتئین ها به غشاء متصل می شوند و الگوی نواری آنها حفظ می شود.

شکل کلی ساندویچ وسترن بلات

پس از انتقال، غشاء به یک محلول حاوی پروتئین های غیر خاص (مانند شیر خشک یا سرم آلبومین) اضافه می شود. این مرحله به مسدود کردن معروف است و هدف آن جلوگیری از واکنش های غیر خاص بین آنتی بادی ها و غشاء است. در صورت عدم مسدود کردن، آنتی بادی های خاص و غیر خاص ممکن است به قسمت های خالی یا دارای پروتئین غیر هدف روی غشاء بچسبند و باعث تولید سیگنال های نادرست شوند.

پس از مسدود کردن، غشاء با یک آنتی بادی خاص که به پروتئین هدف تشخیص داده و متصل می شود، شسته و انکوبه می شود. به این آنتی بادی، آنتی بادی اولیه گفته می شود. آنتی بادی اولیه معمولاً از حیوانات (مانند خرگوش، موش، گوسفند، بز یا گاو) تولید شده و با استفاده از روش های سرولوژیک (ELISA) یا کروماتوگرافی (affinity chromatography) تصفیه شده است.

پس از شستشو، غشاء با یک آنتی بادی دوم که به آنتی بادی اولیه تشخیص داده و متصل می شود، دوباره انکوبه می شود. به این آنتی بادی آنتی بادی ثانویه گفته می شود. آنتی بادی ثانویه معمولاً از گونه های مختلف از حیوانات تولید شده و با استفاده از روش های مشابه با آنتی بادی اولیه تصفیه شده است. آنتی بادی ثانویه به یک عامل روشنایی (مانند فلورسانس یا راديواكتيو) که قابل تصویربرداري است، مرتبط مي شود. عامل روشنایی باعث مي شود كه پروتئين هدف در تصويربرداري قابل رؤيت باشد.

شکل شماتیک نحوه اتصال آنتی بادی اولیه و ثانویه به غشا

پس از شستشو، تصویربرداري از غشاء با استفاده از يك دستگاه مناسب (مانند فيلم X-Ray يا دوربين فلورسانس) صورت مي گيرد. در نهايت ، يك الگوي نواري روي فيلم يا صفحه نمايش ديده مي شود كه نشان دهنده حضور و سايز پروتئين هدف است. همچنین با استفاده از پروتئین های استاندارد با سایز و غلظت شناخته شده، مقدار نسبي پروتئين هدف را نيز مي توان تخمين زد. پروتئین های استاندارد معمولاً از پروتئین های خالص شده یا پروتئین های تجاری که سایز و غلظت آنها معلوم است، تشکیل شده اند. پروتئین های استاندارد به همراه نمونه های حاوی پروتئین هدف در ژل الکتروفورز قرار داده شده و به عنوان مارکر(marker) برای تعیین سایز و غلظت پروتئین هدف استفاده می شوند. البته در صورت عدم استفاده از شناساگر فلورسنت یا رادیواکتیو می توان را رنگ های پانسو-اس، جوهر هندی، آمیدوبلک و کوماسی بلو نیز پروتئین را رنگ آمیزی نمود.