معمولا از روش های مختلفی برای استخراچ پلاسمید استفاده می شود اما کیت های تجاری و قابل دسترسی با قیمت های مناسب در بازار موجود هستند که معمولا کیفیت های قابل قبولی دارند و کار شما را بسیار راحت می کنند. در این مقاله می خواهیم نکات مهم استخراج پلاسمید با کیت استخراج پلاسمید پویاژن آزما به شما بگوییم تا محصولی با کیفیت هرچه بهتر به دست بیاورید.
برای مطالعه پروتکل استخراج پلاسمید کلیک کنید.
پلاسمید قطعه ای حلقوی از جنس DNA است که درون سلول های باکتریایی به صورت طبیعی وجود دارد، تکثیر آن به صورت جداگانه از DNA ژنومی انجام می گیرد و باکتری ها از طریق انتقال افقی می توانند پلاسمیدهایشان را به یکدیگر منتقل کنند. در این مقاله می توانید به تفصیل در مورد آنواع پلاسمیدها بخوانید.
خصوصیات پلاسمیدها باعث شده که محققان از آن ها به منظور وارد کردن یک ژن جدید به دورن باکتری استفاده کنند. پلاسمیدها معمولا دارای یک مارکر انتخابی مثل ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هستند که در جداسازی آن ها به محققان بسیار کمک می کند.
برای جداسازی انواع DNA و باکتری می توانید از کیت های پویاژن آزما تهیه کنید. برای خرید کیت استخراج پلاسمید کلیک کنید.
همچنین شما میتوانید در دوره های کارآموزی پویاژن آزما شرکت کنید تا پس از آموزش، تمامی تکنیک های مهندسی ژنتیک را خودتان انجام دهید. برای اطلاعات بیشتر و ثبت نام کلیک کنید.
1. کشت باید تازه باشد.
همیشه به یاد داشته باشید که کشت تازه بهترین نتیجه و بازده را به شما خواهد داد. یک روز قبل از زمانی که قصد استخراج پلاسمید را دارید حتما یک کشت مایع Overnight تهیه کنید. بهتر است کشت را به مدت 12 تا 18 ساعت انکوبه کنید. زمان کمتر باعث عدم رشد کافی و زمان بیشتر باعث رفتن باکتری به فاز رقابت و مرگ می گردد. در نتیجه روی بازده و کیفیت پلاسمید اثر منفی خواهد گذاشت.
2. شرایط رشد را برای استخراج پلاسمید بهینه کنید.
با توجه به نوع پلاسمید و سویه میزبانی که استفاده می کنید، سعی کنید بهترین شرایط رشد ممکن را برای باکتری در نظر بگیرید. این شرایط شامل موارد مختلفی مثل محیط کشت مورد استفاده، دمای بهینه رشد، مدت زمان مورد نیاز باکتری ، هوادهی و مقدار تلقیح می گردد که به طور مستقیم روی کیفیت پلاسمید استخراج شده تاثیر مستقیم می گذارند.
3. آنتی بیوتیک فراموش نشود!
بالاتر گفتیم که معمولا پلاسمیدها دارای یک مارکر اختصاصی مثل ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هستند. در نتیجه در محیطی که دارای مقداری مناسبی از آن آنتی بیوتیک خاص باشد فقط باکتری های دارای پلاسمید مورد نظر ما رشد خواهند کرد. فراموش نکنید در هنگام کشت، حتما به محیط کشت، آنتی بیوتیک اختصاصی پلاسمید را بیافزایید تا از رشد باکتری های بدون پلاسمید جلوگیری شود.
4. مراقب زمان لیز سلول باشید.
ممکن است تصور کنید که هر چه به محلول فرصت بیشتری برای لیز بدهید بهتر است؛ با این تصور که نکند مقداری DNA در اثر درست لیز نشدن از دست برود. اما درست این است که تا زمانی صبر کنید که یک محلول شفاف به دست آورید و نه بیشتر. زیرا زمان بیش از حد باعث لیز شدن DNA پلاسمیدی شده و در نتیجه کیفیت استخراج را پایین می آورد.
5. سویه میزبان مناسب
هر پلاسمیدی درون یک سویه خاص به خوبی تکثیر می شود، مطمئن شوید پلاسمید شما درون سویه اختصاصی خود کلون شده است.
6. هر پلاسمیدی خصوصیاتی دارد
یکی از این خصوصیات مهم کپی نامبر پلاسمید است. برخی پلاسمیدها کپی نامبر پایینی دارند، یعنی به ازای هر باکتری تعداد کمتر پلاسمید درون آن باکتری تکثیر خواهد شد. کپی نامبر پلاسمید خود را قبل از استخراج چک کنید. اگر پلاسمید دارای کپی نامبر بالا باشد که هیچ، اما اگر تعداد آن کم است می توانید با افزایش مقدار کشت این کمبود را جبران کنید. البته یادتان باشد که برای افزودن مقدار کشت هم محدودیت دارید. و صرفا افزودن رسوب کشت منجر به افزایش بازده نخواهد شد.
7. مرحله خنثی سازی را به خوبی انجام دهید.
پس از افزودن بافر نوترالیزه کننده عجله نکنید. محلول را به آرامی اینورت کنید و صبر کنید تا رسوب سفید رنگ تشکیل شده و پس از آن 2 دقیقه فرصت دهید. خنثی سازی نیمه کاره نیز ممکن است باعث افت کیفیت شدید بازده استخراج گردد.
8. اجزاء سلولی را پیپت نکنید.
پس از مرحله خنثی سازی یک مرحله سانتریفیوژ وجود دارد تا اجزا سلولی از DNA جدا شود؛ بعد از این مرحله باید مایع رویی را که در واقع DNA داخل آن قرار دارد از رسوب جدا کرده و به روی ستون اضافه کنید. مراقب باشید در این مرحله هیچ رسوبی را با پیپت نکشید، چون باعث تداخل در مرحله اتصال DNA به فیلتر ستون شده و کیفیت استخراج را پایین می آورد.
9. الکل اضافه کنید.
بافر W کیت استخراج پلاسمید پویاژن آزما نیاز به افزودن الکل دارد. یک اشتباه رایج در میان محققان فراموش کردن افزودن این مرحله است. قبل از اولین استفاده حتما الکل را بیافزایید و روی ظرف بافر علامت بزنید تا دیگر همکاران شما متوجه شوند.
شرکت پویاژن آزما آزمایشگاه مجاز غذا و دارو می باشد. برای انواع خدمات مربوطه به این لینک مراجعه کنید.
10. با پلاسمیدتان مهربان باشید
یکی از مهم ترین کارها زمان استخراج پلاسمید، جداسازی پلاسمید از DNA ژنومی سلول است. در نتیجه هنگام انجام عمل استخراج تا جایی که امکان دارد با میکروتیوب آرام کار کنید تا DNA ژنومی خورد نشود و ناخالصی وارد پلاسمید اختصاصی نشود. در تمامی مراحل با دقت و آرام عمل اینورت کردن را انجام دهید و عجله نکنید. چرا که عجله فقط موجب خراب شدن نتیجه و نیاز به تکرار آن خواهد شد. در صورت شکست DNA ژنومی، روی ژل آگارز اسمیر مشاهده خواهید کرد.
13. برای بار اول تعداد زیادی نمونه را باهم استخراج نکنید.
معمولا اولین بار که آزمایشی را انجام می دهید احتمال خطا و اشتباه وجود دارد. بهتر است برای بار اول تعداد یک یا دو نمونه را استخراج کنید تا به اصطلاح قلق کار دستتان بیاید. زیاد بودن تعداد نمونه احتمال خطای شما را بالا می برد و بعدا در خطایابی دچار سردرگمی خواهید شد.
15. اندوتوکسین ها را فراموش نکنید.
ما کیت استخراج پلاسمید پوباژن آزما را به گونه ای بهینه کرده ایم که برای سویه های اندونوکلئاز مثبت نیز مناسب باشد. به این صورت که یک مرحله شست و شوی اضافی با بافر EW اندونوکلئازها را به خوبی حذف می کند. پس قبل از شروع کار اطلاعات کامل راجع به سویه میزبان خود داشته باشید.
16. نتیجه را تایید کنید
هر آزمایشی نیاز به تایید نهایی دارد. استخراج پلاسمید نیز از این قاعده مستثنی نیست. بهترین کار برای دید کیفیت و خلوص پلاسمید انجام الکتروفور است. بعد از اتمام عمل استخراج، 5 میکرولیتر از آن را روی ژل الکتروفورز ران کنید تا از کیفیت پلاسمید استخراج شده مطمئن شوید.
17. استخراج پلاسمید عالی انجام دهید.
اگر تمامی نکات گفته شده را رعایت کنید و با استفاده از دستورالعمل موجود در کیت پیش بروید، قطعا پلاسمیدی با کیفیت عالی خواهید داشت. با این حال در صورت داشتن هر گونه سوالی می توانید با ما از طریق ایمیل، شماره های تماس و واتسپ در ارتباط باشید تا همکاران ما شما را راهنمایی کنند.
برای جداسازی انواع DNA و باکتری می توانید از کیت های پویاژن آزما تهیه کنید. برای خرید کیت استخراج پلاسمید کلیک کنید.
برای مطالعه بیشتر در این زمینه می توانید به این لینک مراجعه کنید.
