آموزش رایگان طراحی پرایمر

اولین مرحله برای انجام PCR بعد از تعیین ژن ها، طراحی پرایمر هست. داخل این ویدئو یاد میگیرید چجوری توالی ژن رو پیدا کنید و آموزش رایگان طراحی پرایمر رو خواهید دید. استفاده از انواع سایت و نرم افزار و تمامی نکات موردنیاز برای طراحی پرایمر و بخش بیوانفورماتیک آن در این مقاله توسط پویاژن آزما برای شما عزیزان آورده شده. همچنین برای تمامی خدمات آموزش و طراحی پرایمر و PCR میتوانید با ما تماس بگیرید.

پرایمرها

پرایمرها الیگونوکلئوتیدهایی هستند که برای واکنش PCR لازم هستند. لازم است پرایمرهایی طراحی شوند که مکمل رشته الگو DNA باشند. شرکت پویاژن آزما بصورت تخصصی برای شما طراحی پرایمر برای هر تستی را انجام میدهد. در ادامه برای آموزش طراحی پرایمر بصورت کامل (دستی و استفاده از سایت ها و نرم افزارها) این مقاله را مطالعه و ویدئوی مربوطه را مشاهده کنید.

خاصیت اصلی پرایمرها این است که باید با توالی های الگو مطابقت داشته باشند (باید مکمل رشته الگو باشند). با این حال، لازم نیست که پرایمرها کاملاً با رشته الگو مطابقت داشته باشند. ولی باید انتهای ‘ 3 پرایمر کاملاً با رشته DNA الگو مطابقت داشته باشد تا DNA پلیمراز بتواند طول آن را ادامه دهد. معمولاً از گوانین یا سیتوزین در انتهای’ 3 بیشتر استفاده می شود.

قبل از طراحی پرایمر

برای انجام PCR و داشتن تعداد زیادی از یک ژن خاص ابتدا نیاز داریم یک جفت پرایمر اختصاصی Forward و Reverse که به ابتدا و انتهای ژن موردنظر متصل شود را طراحی و سنتز کنیم. برای اینکار در ابتدا توالی ژن موردنظر را از دیتابیس هایی مثل NCBI پیدا کنید که بصورت عملی در ویدئو میتوانید مشاهده کنید .

نکات طراحی پرایمر

• طول پرایمر باید بین 18 تا 30 نوکلئوتید باشد.
• درصد بازهای GC نزدیک به 50 باشد.
• دمای ذوب دو پرایمر نباید بیشتر از 5درجه سانتی گراد با هم تفاوت داشته باشند.
• در ابتدا و انتهای توالی 1-2 نوکلئوتید C و G قراردهید.
• پرایمرها نباید توالی مکمل داشته باشند.
• دمای ذوب بین 55 تا 65 باشد.

نحوه محاسبه دمای ذوب

نحوه محاسبه دمای ذوب

از طرف دیگر، از پرایمر بلند برای تکثیر نمونه DNA ژنومی یوکاریوتی استفاده می شود. با این حال، یک پرایمر نباید خیلی بلند یا خیلی کوتاه (کمتر از 30 نوکلئوتید) باشد. پرایمرهای کوتاه، باعث ایجاد محصول غیر اختصاصی میشوند و پرایمرهای طولانی سرعت سنتز را بسیار کند میکنند. به طور متوسط، قطعه DNA مورد نیاز برای تقویت باید در اندازه 1-10 کیلوباز باشد.

ساختار پرایمر باید نسبتاً ساده باشد و فاقد ساختار ثانویه داخلی باشد تا از چین خوردگی داخلی جلوگیری شود. همچنین لازم است از اتصال پرایمر-پرایمر جلوگیری شود که باعث ایجاد دایمرهای پرایمر شده و روند رونویسی را مختل می کند. در هنگام طراحی ، اگر مطمئن نیستید که چه نوکلئوتیدی را باید در یک موقعیت خاص درون پرایمر قرار دهید، می توان بیش از یک نوکلئوتید را در آن موقعیت قرار داد که به آن سایت مخلوط گفته می شود. همچنین می توان از یک مولکول نوکلئوتید (اینوزین) به جای نوکلئوتید معمولی برای قابلیت های جفت سازی گسترده تر استفاده کرد.

در ویدئو نحوه استفاده از سایت NCBI برای دریافت توالی ژن موردنظر و طراحی پرایمر با سایت های NCBI، Primer3 و IDT و نرم افزارهای Gene runner و Snap Gene بصورت عملی گفته شده و شما میتوانید توالی های پرایمری که بصورت دستی خودتان طراحی کرده اید را با پرایمرهای این سایت ها و نرم افزارها مقایسه کرده و بهترین توالی را انتخاب کنید.

برای مطالعه بیشتر میتوانید از سایت addgene  استفاده کنید.

سوالات متداول

چه مشکلاتی به دلیل صحیح نبودن توالی پرایمر ایجاد میشود؟

• ایجاد پرایمر دایمر
• ایجاد ساختارهای ثانویه درون پرایمر (ایجاد hairpin)
• اتصال غیراختصاصی
• اتصال ضعیف به توالی موردنظر