در بخش قبل درباره چگونگی شناسایی باکتری ها به روش مولکولی صحبت کردیم. این روش با تعیین سکانس توالی 16s rRNA انجام می شود. همانطور که گفتیم پس از استخراج DNA ، انجام PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن 16s rRNA و تخلیص آن از روی ژل آگارز باید تعیین سکانس انجام شود. یکی از روش های تعیین توالی سنگر هست. آزمایشگاه همکار غذا و دارو پویاژن آزما در این مقاله قصد دارد بطور مفصل این روش را برای شما توضیح دهد.
همچنین اگر قصد دارید بصورت عملی این روش را یاد بگیرید و خودتان انجام دهید برای کارآموزی با ما تماس بگیرید.
09101438051
02140443676-7
اولین روش ابداع شده برای تعیین توالی سنگر هست که در سال 1977 توسط فردریک سنگر ارائه شد. از آن زمان تا کنون تغییراتی بر روش اصلی اعمال شده و این روش بهبود و توسعه یافته ولی همگی اساس یکسانی دارند. همچنین روش سنگر رایجتر از بقیه روش های تعیین سکانس است.
در این روش با استفاده از یک پرایمر (یا فوروارد یا ریورس) یک قطعه ژن اختصاصی را تعیین توالی می کنیم.
مواد موردنیاز برای تعیین سکانس به روش سنگر
موادی که در این روش استفاده میکنیم به PCR شباهت دارد. به این صورت:
- dNTP
- پرایمر (فقط یکی، فوروارد یا ریورس)
- DNA پلیمراز
- نوکلئوتیدهای تغییر یافته و نشاندر شده (این نوکلئوتیدها مانع از ادامه ساخته شدن توالی میشوند، به این صورت که OH آزاد انتهایی از آنها حذف شده تا به فسفات متصل نشده و قابلیت تشکیل پیوند فسفودی استر را ندارند.)
نوکلئوتیدهای تغییریافته و نشاندار شده
مراحل تعیین سکانس به روش سنگر
1. نمونه DNA را به 4 میکروتیوب جدا میریزیم، یا به 4 دسته تقسیم میکنیم.
2. به تمامی میکروتیوب ها dNTPهای معمولی، آنزیم DNA پلیمراز و پرایمر را اضافه میکنیم.
3. در این مرحله به هر میکروتیوب یکی از نوکلئوتیدهای تغییریافته A، T، C و G را اضافه میکنیم.
4. در این مرحله از تعیین توالی سنگر مواد را درون دستگاه ترموسایکلر قرار داده و دماهای زیر به دستگاه داده می شود :
ابتدا دمای بالا یعنی 94 درجه سانتی گراد را نیاز داریم تا دو رشته از هم جدا شوند .
سپس دمای اتصال پرایمر که در بخش پروتکل PCR مفصل این مورد را بررسی کردیم .
دمای عملکرد آنزیم DNA پلیمراز .
دمای غیرفعال شدن آنزیم .
5. پس از سنتز ژن با یک پرایمر و نوکلوتیدهای تغییریافته و نشاندار محصول نهایی روی ژل پلی آکریلامید ران میشود تا بر اساس اندازه مرتب شوند.
6. خوانش رنگ های فلورسنت توالی های مرتب شده توسط دستگاه (هر نوکلئوتید یک رنگ متفاوت).
آزمایشگاه همکار غذا و دارو پویاژن آزما بصورت تخصصی شناسایی مولکولی تمامی آلودگی های میکروبی و پروبیوتیک ها را انجام می دهد .
ساز و کار و نحوه عملکرد تعیین سکانس سنگر
وقتی آنزیم DNA پلیمراز از روی توالی الگو می سازد، به محض آنکه به جایگاه نوکلئوتید مکمل با نوکلئوتید نشاندار رسیده و نوکلئوتید نشاندار را قرار میدهد، سنتز متوقف میشود. این روند مدام تکرار میشود و گاهی نوکلئوتید معمولی و گاهی نوکلئوتید تغییر یافته قرار می گیرد. به این صورت در هر میکروتیوب قطعاتی با اندازه های مختلف و اختلاف یک نوکلئوتید خواهیم داشت.
پس از ران شدن هر یک از 4 میکروتیوب در چاهک جداگانه از ژل پلی آکریلامید قطعات بسیاری از DNA با اندازه های مختلف خواهیم داشت. در روش سنتی سنگر بر اساس ترتیب قرار گیری باندها، ترتیب نوکلئوتیدها را مشخص میکردند.
هریک از نمونه ها را در چاهک جداگانه ژل پلی آکریلامید ران میکنیم و از ترتیب قرارگیری باندها ترتیب توالی را مشخص میکنیم
به صفحه تصفیه فاضلاب صنعتی مراجعه نمایید
اما امروزه پس از آنکه توالی ها روی ژل پلی آکریلامید به ترتیب اندازه قرار گرفتند، آنها را از دستگاه عبور میدهیم تا نور فلورسنت هریک را خوانش کرده و نوکلئوتید آن را به ترتیب برای ما می نویسد.
خوانش فلورسنت هر نوکلئوتید توسط دستگاه و نتیجه ای که ارائه میدهد.
نکته: فراموش نکنید بسته به نوع پرایمری که توالی یابی با آن انجام شده (فوروارد یا ریورس) شما باید توالی بدست آمده یا مکمل آن را برای کار خود درنظر بگیرید. برخی از سایت ها برای blast هر دو را در نظر گرفته و برخی از شما سوال میکنند که از کدامیک پرایمرها استفاده کرده اید.
تحلیل نتایج تعیین توالی سنگر
نتایج این روش بصورت شکل زیر به شما ارائه میشود. در هر نوکلئوتید که فقط یک رنگ پیک و پیک بلندتری را مشاهده میکنید نتیجه دقیقتری را نشان میدهد. اما اگر نمونه خالص نبوده یا تعیین توالی به خوبی انجام نشده باشد پیک های تمیز و مشخصی نخواهید داشت.
نمونه ای از نتیجه بسیار مناسب تعیین سکانس سنگر
سوالات متداول
چرا محصول تعیین سکانس را روی ژل پلی آکریلامید ران میکنیم نه آگارز؟
ژل پلی آکریلامید قطعات با اندازه نزدیک را با وضوح بهتر جدا کرده و شما در این روش که تفاوت توالی ها یک نوکلئوتید هست با پلی آکریلامید میتوانید از یکدیگر تمیز دهید.
دمای مناسب برای اتصال پرایمر چیست؟
در این لینک بطور مفصل درباره تمامی دماهای موردنیاز توضیح داده شده است .
