مهندسی ژنتیک – مرحله لایگیشن
اصول مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن را در مقالات قبل توضیح دادیم . این آخرین مرحله ایجاد پلاسمید نوترکیب است . به دلیل استفاده از آنزیم T4 DNA لیگاز به این مرحله لایگیشن می گوییم . این آنزیم با ایجاد پیوند فوسفودی استر باعث اتصال دو انتهای DNA با اتصال Oh آزاد یک رشته به فسفات رشته ی دیگر می شود . برای توضیحات کامل تر و روش انجام این مرحله با ما همراه باشید.
مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن
- استخراج پلاسمید و ژن که میتوانید از انواع کیت استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید
- دایجستشن با آنزیم های محدود کننده و الکتروفورز
- لایگیشن (ligation)
- ترنسفورم به باکتری میزبان و کشت باکتریها (transform)
- انتخاب کلونی (colony selection)
- کشت باکتری برای تولید پروتئین موردنیاز
- تخلیص پروتئین
نکته: دقت کنید که برای اطمینان از صحت انجام کلونینگ ژن مراحل مختلف باید هر مرحله استخراج، PCR، الکتروفورز و برای اطمینان کامل تعیین سکانس ژن موردنظر انجام شود.
مرحله لایگیشن
موفقیت در کلونینگ به درست انجام شدن لایگیشن وابسته است. برای یک لایگیشن مناسب شما باید از آنزیم محدودکننده مناسب استفاده کنید. بعد از هضم آنزیمی (دایجست) پلازمید حامل و ژن موردنظر با یک آنزیم محدودکننده، باید ژن موردنظر و پلازمید در یک جهت مناسب (برای رونویسی درست از ژن) با استفاده از انتهای چسبنده متصل شوند.
تصویری از عملکرد آنزیم لیگاز که از انتهای آزاد یک رشته استفاده کرده و با مصرف ATP آن را به فسفات رشته مقابل متصل میکند
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
اگر در ژن انتهای چسبنده مناسب مجود ندارد باید با استفاده از DNA پلیمراز و dNTP ها این انتهای چسبنده ایجاد شده و یا با استفاده از PEG آنها را به یکدیگر متصل کنید.
مواد موردنیاز برای انجام لایگیشن در کلونیگ ژن
- DNA تخلیص شده و دایجست شده
- پلازمید تخلیص شده و دایجست شده
- T4 DNA لیگاز 0/5 تا 1 میکرولیتر
- بافر آنزیم T4 DNA لیگاز
- آب مقطر بدون نوکلئاز (حجم نهایی 10 میکرولیتر)
مقدار ژن و پلازمید به اندازه و غلظت آنها بستگی دارد. اما در یک کلونینگ معمولی که اندازه ژن کوچکتر از پلازمید است معمولا با نسبت 3 به یک (ژن 3 برابر پلاسمید) مناسب خواهد بود و 100 نانوگرم از DNA میتواند برای یک لایگیشن استاندارد کافی باشد. برای محاسبه مقادیر میتوانید از سایت محاسبه لایگیشن هم استفاده کنید.
مراحل انجام لایگیشن برای کلونینگ ژن
ابتدا بافر آنزیم لیگاز را ازفریزر خارج کنید تا به دمای محیط برسد و به یک میکروتیوب تمیز اضافه کنید. سپس به ترتیب وکتور (پلاسمید)، ژن موردنظر، آب مقطر بدون نوکلئاز و در آخر آنزیم را اضافه کنید.
مخلوط را آهسته هم بزنید و مطمئن شوید هیچ قطره ای در دیواره های میکروتیوب نباشد.
لایگیشن برای دایجستشن (برای مطالعه دایجستشن وارد این بخش شوید) با انتهای صاف در دمای پایین و در مدت زمان طولانی انجام میشود اما برای انتهای چسبنده دمای بالاتر مثل دمای اتاق و در مدت زمان کمتر انکوبه میشود. انکوباسیون 3 تا 6 ساعت رایج هست اما گفته میشود 30 دقیقه نیز میتواند کافی باشد. میتوان به مدت یک شب در 16 درجه سانتی گراد نیز انکوبه کرد. 2 ساعت در دمای اتاق نیز در سایت addgene پیشنهاد شده است.
در مرحله بعد میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه در 65 درجه سانتی گراد قرار داده تا آنزیم غیرفعال شود.
در نهایت شما پلاسمید نوترکیب خواهید داشت و این مخلوط برای ترنسفورم و انتقال به سلول میزبان آماده است که میتوانید در مقاله بعدی آن را مطالعه کنید.
نکته : اگر غلظت DNA شما کم بود و نمیتوانستید 100 نانوگرم در 10 میکرولیتر را بردارید، حداکثر میزان ممکن را اضافه کنید و مطمئن شوید که به همان میزان میزان بافر را افزایش داده و 1 میکرولیتر از آنزیم لیگاز نیز کافی خواهد بود.
پیشنهاد : بافر لیگاز حاوی ATP است و باید در فریزر نگهداری شود، بهتر است که یکبار یخ آن را باز کنید (thaw) و در چند میکروتیوب با مقدارهای 5 یا 10 یا 20 میکرولیتر (بسته به تعداد نمونه هایی که کار میکنید) تقسیم کنید و آنها را در 20- درجه نگهداری کنید. هرگاه نیاز به لایگیشن داشتید یکی از آنها بردارید و بار بعدی همان میکروتیوب که یکبار استفاده شده بردارید و استفاده کنید. در این صورت تمامی بافر را مرتبا فریز و دفریز نمیکنید.
توجه : همیشه نمونه کنترل هم داشته باشید.
