آموزش کامل ترنسفورمیشن

پس از آنکه در مراحل قبل پلاسمید نوترکیب را تهیه کردید حالا نوبت به آن میرسد تا پلازمید نوترکیب را به سلول میزبان منتقل کنید. اهداف و مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن را بطور کلی در مقالات قبل توضیح دادیم. در این مقاله به چگونگی انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری میزبان یعنی ترنسفورمیشن میپردازیم.

برای مشاوره و کارآموزی مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن میتوانید با ما تماس بگیرید:

09101438051

02140443676-7

مراحل مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن

بطور مختصر مراحل مهندسی ژنتیک بصورت زیر است که در این مقاله مرحله ترنسفورمیشن را به تفصیل توضیح خواهیم داد.

• استخراج پلاسمید و ژن که میتوانید از انواع کیت استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید
• دایجستشن با آنزیم های محدود کننده (digestion) و الکتروفورز
• لایگیشن (ligation)
• ترنسفورم به باکتری میزبان و کشت باکتریها (transform)
• انتخاب کلونی (colony selection)
• کشت باکتری برای تولید پروتئین موردنیاز
• تخلیص پروتئین

نکته: دقت کنید که برای اطمینان از صحت انجام کلونینگ ژن مراحل مختلف باید هر مرحله استخراج، PCR، الکتروفورز و برای اطمینان کامل تعیین سکانس ژن موردنظر انجام شود.

مرحله ترنسفورمیشن

ترنسفورمیشن مرحله ای از مهندسی ژنتیک و کلونینگ ژن است که در آن یک ژن خارجی را به یک سلول منتقل میکنیم. ترنسفورمیشن یک پلازمید نوترکیب به یک باکتری، هم برای ذخیره آن ژن و هم برای تولید آن ژن بکار میرود. به همین دلیل علاوه بر پلاسمیدهایی که برای ژن به باکتری منتقل میشوند، پلاسمیدهایی که برای بیان در سلولهای پستانداران تهیه شده اند، حامل توالی مبدا همانندسازی باکتری و یک ژن مقاومت به آنتی بیوتیک برای انتخاب کلونی باکتری نیز هستند.

دانشمندان سویه های متنوعی از باکتری های ایجاد کرده اند که راحت تر ترنسفورم شوند و پلاسمید را برای مدت طولانی بدون تغییر در خود نگه دارند. برخی شرکت ها سلول های آماده ترنسفورم را بصورت فریز می فروشند؛ شرکت پویاژن آزما نیز بر اساس درخواست شما عزیزان سلول مستعد آماده ترنسفورم را برای شما ارسال میکند.

وسایل موردنیاز برای ترنسفورمیشن

• انکوباتور شیکردار (37درجه سانتی گراد)
• انکوباتور معمولی (37 درجه سانتی گراد)
• بن ماری (42 درجه سانتی گراد)
• بشر یا یک ظرف پر از یخ
• میکروتیوب
• وسایل استریل (سر سمپلر و میکروتیوب و وسایل کشت باکتری)

مواد موردنیاز برای ترنسفورمیشن

• پلیت موردنیاز LB آگار (حاوی آنتی بیوتیکی که پلاسمید شما ژن مقاومت به آن را دارد.)
• محیط کشت LB مایع
• پلازمید و DNA موردنظر
• سلولهای میزبان

مراحل تهیه سلول های مستعد

1. ابتدا یک یا دو کلنی از باکتری را درون 5 میلی لیتر محیط کشت LB مایع کشت داده و اجازه دهید درون انکوباتور شیکردار در 37 درجه سانتی گراد رشد کنند تا کدورت رشد باکتریها به 2/0 تا 6/0 = ₆₀₀OD برسد (معمولا 3-4 ساعت).
2. میکروتیوب ها را درون فریزر قرار دهید تا هنگام استفاده سرد باشند. هنگامیکه به مقدار کافی رشد کردند در هر میکروتیوب یک میلی لیتر از سلولها را بریزید و سانتریفیوژ کنید.
3. رسوب را در 1 میلی لیتر CaCl₂ سرد استریل حل کرده 30 دقیقه روی یخ قرار دهید و سپس سانتریفیوژ کنید.
4. محلول رویی را دور ریخته و در هر میکروتیوب 200 میکرولیتر CaCl₂ سرد استریل اضافه کنید.
5. برای رسیدن به بهترین حالت 24 ساعت درون یخچال قرار دهید. در طول 24 ساعت سلولها بطور افزایشی برای ترنسفورم بهتر شده و بعد از آن عملکردشان کاهش یافته و پس از یک هفته به حداقل عملکرد خود میرسد.

خلاصه ای از عملکرد ترنسفورمیشن

اموزش ترنسفورمیشن Dna

روش های ترنسفورمیشن

دو روش اصلی برای ترنسفورمیشن در آزمایشگاه استفاده میشود: ترنسفورمیشن شیمیایی و الکتروپوریشن (Electroporation).

ترنسفورمیشن شیمیایی

در این روش با استفاده از یون های کلسیم، سلولهای مستعد (cell competent) ایجاد میشود. به این صورت که با افزودن کلسیم کلرید به سلولها، به دلیل مثبت بودن یون کلسیم و منفی بودن بار غشاء، یون کلسیم در اطراف غشاء قرار گرفته و باعث جذب پلاسمید که بار منفی دارد میشود. همچنین یون کلسیم تولید PABA (پلی آمینو بوتریک اسید) را القا کرده که باعث افزایش کانالهای سطح غشاء میشود. که روش استفاده از این ماده برای ترنسفورمیشن را در تهیه سلولهای مستعد توضیح دادیم.

اما برای بهبود این روش و اثر بخشی بهتر آن، از شوک دمایی بصورت زیر استفاده میکنیم:

• سلول هایی که در مرحله قبل تهیه کردید را از یخچال خارج کنید. به 50 میکرولیتر از سلول ها 0/25 نانوگرم از پلاسمید (حدود 2/5 میکرولیتر) افزوده و روی یخ قرار دهید.
• 30 دقیقه روی یخ انکوبه کنید.
• 90ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتی گراد قرار دهید تا شوک دمایی به آن وارد شود.
• 1 دقیقه روی یخ قرار دهید.
• 1میکرولیر از محیط LB مایع به آن افزوده و به مدت 45 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
• 100 میکرولیتر از آن را روی محیط کشت جامد حاوی آنتی بیوتیک کشت دهید.

روش دیگر ترنسفورمیشن

روش های دیگری نیز برای ترنسفورمیشن وجود دارد که تفاوت های کمی باهم دارند و میتوانید از سایت molbi  برخی از آنها را بخوانید.

کلونی هایی که در این محیط رشدکنند حامل پلاسمید هستند. اما ممکن است در مرحله لایگیشن ژن موردنظر ما درون پلاسمید نبوده و پلاسمید به انتهای خودش متصل شده باشد اما به دلیل وجود ژن مقاومت به آنتی بیوتیک در این محیط رشد میکند. برای انتخاب کلونی های حاوی ژن موردنظر، روش های متنوعی وجود دارد که در مقاله بعدی خواهیم گفت.