اصول و پروتکل PCR

PCR تکنیکی بسیار مهم و مورد استفاده در تمامی زمینه های بیولوژی و پزشکی می باشد. می توانید در مقاله تاریخچه ایجاد تکنیک PCR را مشاهده کنید. شرکت دانش بنیان پویاژن آزما دارای مجوز سازمان غذا و دارو برای کنترل کیفی و شناسایی مولکولی تمامی میکروارگانیسم ها از جمله پروبیوتیک ها می باشد.

قصد داریم در این مقاله شما را با اهداف و اصول کلی این تکنیک پرکاربرد آشنا کنیم.

اهداف PCR چیست؟

در واقع این تکنیک ایجاد شده تا شما بتوانید در مدت زمان بسیار کم میزیان زیادی از یک ژن خاص داشته باشید.

این تکنیک در موارد بسیاری می تواند شما را یاری کند. از جمله:

• هنگامی که به دنبال یک ژن خاص می گردیم.
• برای بررسی حضور و عدم حضور یک ژن خاص برای مثال شناسایی مولکلولی میکروارگانیسم ها، تشخیص بیماری و…
• تکثیر یک ژن خاص و جداسازی آن.
• برای کلون کردن یک ژن، نیاز داریم پس از استخراج DNA (می توانید از کیت های استخراج DNA از انواع نمونه استفاده کنید.) با پرایمرهای اختصاصی ژن موردنظر PCR انجام دهیم.
• برای مهندسی ژنتیک ، در هر مرحله برای تایید صحت انجام مراحل کلونینگ با استفاده از PCR و سپس تعیین سکانس می توانیم از حضور ژن اختصاصی اطمینان حاصل کنیم.

• بررسی الگوی تکاملی

و کاربردهای دیگر که میتوانند بسیار زیاد باشند.

کلیات پروتکل PCR

1. استخراج RNA یا DNA (می توانید از کیت های مختلف استخراج DNA بسته به نمونه مورد نظر استفاده کنید.)
2. آماده سازی مواد واکنش در میکروتیوب 0.2
3. قرار دادن میکروتیوب درون دستگاه و تنظیم دستگاه با دماهای موردنیاز
4. انجام الکتروفورز ژل آگارز برای PCR معمولی

مواد موردنیاز برای PCR

• dNTP (مخلوطی از انواع نوکلئوتید) 0/2 میلی مولار
• MgCl₂ حداکثر 2 میلی مولار
• آنزیم DNA پلیمراز
• بافر آنزیم
• پرایمر های Forward و Reverse، از هریک 10 تا 25 پیکومول
• ژنوم حاوی رشته الگو
• آب مقطر

تصویری از قرار دادن میکروتیوب آماده شده با مواد واکنش، درون دستگاه PCR

تنظیم دستگاه PCR

بعد از آنکه تمامی مواد واکنش را درون میکروتیوب ریختید آن را در دستگاه قرار داده و این دماها را به دستگاه بدهید:

دمای دناتوراسیون (denaturation)

 برای جدا شدن رشته های DNA از یکدیگر به دمای بالا نیاز دارد. اولین دما را حدود 94 تا 98 درجه سانتی گراد قرار می دهیم.

دمای اتصال (Annealing)

 در این دما پرایمر به محل هایی که با آن ها مکمل است متصل می شود. میزان این دما اهمیت بسیار زیادی دارد که به توالی پرایمر طراحی شده بستگی دارد. روش های طراحی آن با انواع سایت و نرم افزار را به طور مفصل در این لینک توضیح داده ایم.

این دما معمولا بین 55 تا 65 درجه سانتی گراد است؛ به این دلیل که یک جفت پرایمر داریم دمای اتصال آن ها نباید بیشتر از 5 درجه تفاوت داشته باشد. اگر دما پایین باشد پرایمر باندهای غیراختصاصی خواهد داد و اگر خیلی بالا باشد پرایمر متصل نمی شود.

دمای طویل سازی (extension)

 این دما به نوع آنزیم مورد استفاده وابسته است و معمولا بین 68 تا 72 درجه سانتی گراد می باشد. در این دما آنزیم ها عمل کرده و از ادامه ی پرایمر شروع به ساخت از روی ژن الگو می کنند (که ژن اختصاصی ما است).

این دماها 30 تا 35 سیکل تکرار می شوند و در هر سیکل ژن موردنظر ما دو برابر می شود. بعد از پایان PCR محصول را روی ژل آگارز ببرید تا با توجه به اندازه ی باند (طبق مارکر) از درست انجام شدن PCR تا حدی اطمینان پیدا کنید. اما برای اطمینان صد درصدی باید نمونه را از روی ژل مجددا تخلیص کرده و برای تعیین سکانس ارسال کنید تا مطمئن شوید ژن موردنظرتان به درستی PCR شده است.

تصویری از تنظیم دماهای موردنیاز برای پروتکل PCR در دستگاه ترموسایکلر Bio-Rad

اگر میزان RNA زیاد بود به درون محلول واکنش PCR مقداری RNase نیز اضافه کنید.

مطالعه بیشتر درباره اصول و پروتکل PCR در ویکی پدیا

سوالات متداول

از کجا بدانم چه آنزیم DNA پلیمرازی برای PCR مناسب است؟

آنزیم DNA پلیمراز دارای 4 فاکتور مختلف است که با توجه به اهداف تحقیق می توانید آنزیم مناسب خود را بیابید. دانستن این 4 فاکتور اساسی به این لینک مراجعه کنید.

چرا اختلاف دمای 2 پرایمر نباید بیشتر از 5 درجه باشد؟

Tm در واقع دمایی است که در آن نیمی از پرایمرها به رشته ی DNA نمونه متصل شده اند. برای کارای بهتر هر دو پرایمر هر چه اختلاف دمای آن ها کمتر باشد محصول PCR بهتری خواهیم داشت. اگر این اختلاف دما بیشتر از 5 درجه شود به احتمال زیاد واکنش PCR انجام نخواهد شد. اطلاعات بیشتر: https://pgazma.com/design-primer

در این مقاله سعی کردیم پروتکل PCR را برای شما شرح دهیم. امیدواریم که مفید واقع شده باشد.