قبل از هر چیز توصیه می کنیم که قبل از خواندن این متن مطالب مربوط به اصول اولیه کشت سلول و همچنین آموزش دفریز کردن سلولها را بخوانید. در این بخش مراحل پاساژ سلول ها و تمامی نکاتی که برای پاساژ سلول به آن نیاز دارید آورده شده است.
وقتی سلولهایی که کشت دادید به تراکم بالای ۷۰ درصد برسند باید آنها را پاساژ بدهید (به این معنی که سلولها را مجدد کشت بدید). برای پاساژ سلولهای چسبنده طبق ویدیوی زیر عمل کنید. به یاد داشته باشید که تمامی وسایل یکبار مصرف باید استریل باشند و هر وسیله ای را وارد هود میکنید حتما الکل کشی کنید.
برای پاساژ سلولها ابتدا مانند هر کار دیگری که با سلول قرار است انجام شود، محیط هود را با الکل استریل کرده و وسایل مورد نیاز را هم پس از الکل کشی زیر هود قرار دهید و لامپ UV را به مدت ۲۰ دقیقه روشن کنید تا محیط برای کار با سلول و پاساژ سلولها کاملا استریل شود (هنگامی که لامپ UV روشن است درب هود بسته و فن را خاموش کنید.)
وسایل مورد استفاده پاساژ سلول
- سمپلر 1000-100 میکرولیتر متغیر
- رک حاوی سر سمپلرهای آبی (هزار)
- فالکون سانتریفیوژ
- فلاسک مورد نیاز برای پاساژ سلولها
فراموش نکنید که در این بین تریپسین، محیط کشت کامل (حاوی FBS) و بافر برای شست و شو ( مانند بافر PBS) را در بن ماری با دمای ۳۷ قرار دهید.
مراحل پاساژ سلول
ابتدا فلاسک حاوی سلول را زیر میکروسکوپ اینورت بررسی کنید تا مطمئن شوید سلولها به تراکم مناسب رسیده باشند. سپس فلاسک را با احتیاط زیر هود برده و محیط کشت را دور بریزید. بعد با بافر سلولها را بشویید تا سلولهای مرده ی شناور را خارج کنید. سپس برای کندن سلولها از کف فلاسک مقدار مناسب از تریپسین (بسته به نوع سلول و حجم فلاسک) را بطور کامل روی سلولها پخش کنید. برای مثال در فلاسک T25 حاوی سلولهای سرطانی می توانید ۲۰۰ تا ۵۰۰ میکرولیتر از تریپسین بریزید. سپس در انکوباتور قرار دهید تا تریپسین عمل کند.
پس از خروج فلاسک و زدن یک ضربه آهسته آن را زیر میکروسکوپ بررسی کنید تا مطمئن شوید سلولها از کف فلاسک کنده شدند. آن را سریع به زیر هود منتقل کنید و محیط کشت کامل را به اندازه دو برابر حجم تریپسین به آن اضافه کنید تا سرم داخل آن تریپسین را مهار کند، در غیر این صورت می تواند به سلولها آسیب بزند.
سلول های کنده شده را کاملا با محیط کشت جمع کرده و به فالکون سانتریفیوژ وارد کنید. سپس به مدت ۵ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.
محیط رویی را دور ریخته و پلت سلولی را در یک سی سی محیط کشت حل کنید.
در مرحله بعد باید شمارش سلولی انجام دهید که می توانید از اینجا روش انجام شمارش سلول ها را ببینید. پس از شمارش سلولها تعیین کنید که چه مقدار از سوسپانسیون را برای رشد مناسب سلولها در مدت زمان موردنیازتان به فلاسک وارد کنید یا در چند فلاسک تقسیم کنید. در این مرحله می توانید برای انجام تست های بیشتر سلول ها را در پلیت های مختلف پخش کنید . سپس میزان مناسب از محیط کامل را اضافه کرده و فلاسک را در انکوباتور قرار دهید. به این صورت پاساژ سلول های را با موفقیت انجام داده اید.
این مقاله سومین مقاله از سری آموزش های مربوط به کشت سلولی بود که تقدیم حضور شما شد.ممنون از شما که با مقاله پاساژ سلول ها ما را همراهی کردید.
مطالعه بیشتر (انگلیسی) :
