برای آموزش دفریز سلولها برای استفاده در کشت سلول این مقاله را مطالعه کنید.
برای کشت سلول شما نیاز دارید سلول‌هایی که برای نگهداری طولانی مدت در کرایوتیوب فریز شده اند را دفریز کنید. این فرایند فریز و دفریز باعث از دست رفتن تعداد زیادی از سلولها می‌شود که به دلیل حضور DMSO و شوک دمایی اجتناب ناپذیر است. به همین دلیل شما باید دفریز را با بالاترین سرعت ممکن انجام دهید.
قبل از خواندن این مقاله، اصول کشت سلول و نکاتی که باید رعایت کنید را مطالعه فرمایید.
همچنین میتوانید برای استخراج ژنوم از سلول ها از کیت استخراج DNA از بافت و سلول پویاژن آزما استفاده کنید.
انتقال سلول
برای دفریز سلول ها، پس از استریل شدن وسیله ها زیر هود لامینار با لامپ UV و به دما رسیدن محیط کشت کامل (محیط کشت حاوی سرم 10% و آنتی بیوتیک 1%) کرایوتیوب حاوی سلول ها را سریعا به اتاق کشت منتقل کنید. برای دفریز سلول ها چند روش وجود دارد که در ادامه باهم بررسی میکنیم.
سلول های فریز شده درون رک تانک ازت
نکات مشترک روشهای مختلف
در تمامی روش ها چیزی که اهمیت دارد این است که DMSO موجود در کرایوتیوب (ماده شیمیایی مورد استفاده در فریز سلول) سریعا توسط سرم غیرفعال شود.
پس در همگی سعی بر این است که به محض آب شدن سلول ها محیط کشت حاوی سرم به آنها اضافه شود. در نتیجه تعداد سلولهای زنده افزایش و میزان سلولهای از بین رفته کاهش خواهد یافت.
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
روش دفریز سلول
در این روش وقتی سلول را به اتاق کشت بردید، کرایوتیوب را درون بن ماری با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نگه دارید تا سریع آب شود.
در مرحله اول کرایوتیوب را درون بن ماری نگه دارید تا یخی دیده نشود
زمانی که یخ‌ها آب شدند، کرایوتیوب را به هود لامینار منتقل کنید. بعد از آن سریعا ۲ سی سی محیط کشت کامل را به مرور به کرایو اضافه کرده . سپس خیلی آهسته پیپتاژ کنید. سپس به فالکون سانتریفیوژ منتقل کنید که DMSO خنثی شده و سلولها کمترین آسیب ممکن را ببینند .
تصویری از ریختن سلولها به درون فالکون برای سانتریفیوژ
به مدت ۵ دقیقه در ۱۲۰۰ دور سانتریفیوژ کنید. محیط رویی که حاوی DMSO را دور ریخته و رسوب سلول را درون یک سی سی محیط کامل سوسپانسیون کنید و به فلاسک منتقل کرده و محیط کشت کامل را به آن اضافه کنید.
در روش دیگری میتوانید سلولها را قبل از سانتریفیوژ به درون فلاسک بریزید ولی در این صورت لزوما روز بعد محیط سلول ها را تعویض کنید.
همچنین میتوانید پس از خارج کردن کرایو از تانک ازت آن را در دستان خود گرم کنید تا یخ به اندازه یک نقطه در کرایو باقی بماند، سپس محیط کامل (حداقل یک سی سی) را بصورت قطره قطره و آرام به کرایو افزوده و بقیه مراحل را مثل روش قبل ادامه دهید.
نکات مهم
- وقتی سلولها را به فلاسک منتقل کردید حتما فلاسک را به شکل 8 انگلیسی حرکت دهید تا سلولها همه جای فلاسک پخش شوند. اگر سلولها به خوبی پخش نشوند در یکجا تجمع کرده و نمی توانند به خوبی رشد کنند در نتیجه نمی توانند به خوبی تقسیم شوند و از فلاسک کنده می‌شوند.
- بهتر است سلولها را شمارش کنید مقدار سلول ها اگر کم باشد سلولها رشد نمی کنند. سلول‌هایی که درون فلاسک می ریزید باید بتوانند با هم ارتباط برقرار کرده و سیگنال منتقل کنند. از طرفی نباید در یک ناحیه تجمع کنند در این صورت به دلیل کمبود جا جدا شده و می میرند.
- سعی کنید هر روز به سلولها سر بزنید و زیر میکروسکوپ ببینید که سلولها چسبیده باشند و تعداد سلولهای شناور (مرده) زیاد نباشد.
- هنگامی که محیط کشت به رنگ زرد متمایل شد، محیط قدیمی را دور ریخته و محیط کشت جدید به فلاسک اضافه کنید.
- برای مطالعه دقیق‌تر مراحل دفریز سلول میتوانید به زبان انگلیسی از سایت cellero مطالعه کنید.
برای استخراج DNA از سلولها میتوانید از کیت استخراج DNA از بافت و سلول استفاده کنید.
این مقاله ادامه دارد و می توانید بخش های بعدی مربوط به کشت سلول را در مقاله های آینده بخوانید.
یک نظر در “آموزش کشت سلول – مرحله دفریز سلول”
سپاس از شما