برای آموزش دفریز سلولها برای استفاده در کشت سلول این مقاله را مطالعه کنید
برای کشت سلول شما نیاز دارید سلول‌هایی که برای نگهداری طولانی مدت در کرایوتیوب فریز شده اند را دفریز کنید. این فرایند فریز و دفریز باعث از دست رفتن تعداد زیادی از سلولها می‌شود که به دلیل حضور DMSO و شوک دمایی اجتناب ناپذیر است. به همین دلیل شما باید دفریز را با بالاترین سرعت ممکن انجام دهید.
قبل از خواندن این مقاله اصول کشت سلول و نکاتی که باید رعایت کنید را از اینجا بخوانید.
همچنین میتوانید برای استخراج ژنوم از سلول ها از کیت استخراج DNA از بافت و سلول پویاژن آزما استفاده کنید.
انتقال سلول
برای دفریز سلول ها، پس از استریل شدن وسیله ها زیر هود لامینار و به دما رسیدن محیط کشت کامل (حاوی سرم و آنتی بیوتیک) کرایوتیوب حاوی سلولها را سریعا به اتاق کشت منتقل کنید. برای دفریز سلول ها چند روش وجود دارد.
سلول های فریز شده درون رک تانک ازت
نکات مشترک روشهای مختلف
در تمای روش ها چیز که اهمیت دارد این است که DMSO موجود در کرایوتیوب (ماده شیمیایی مورد استفاده در فریز سلول) سریعا توسط سرم غیرفعال شود.
پس در همگی سعی در این هست که به محض آب شدن سلولها محیط کشت حاوی سرم به آنها اضافه شود. در نتیجه تعداد سلولهای زنده افزایش و میزان سلولهای از بین رفته کاهش خواهد یافت.
روش دفریز سلول
یک روش این هست که وقتی سلول رو به اتاق کشت بردید، کرایوتیوب را درون بن ماری با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نگه دارید تا سریع آب شود.
در مرحله اول کرایوتیوب را درون بن ماری نگه دارید تا یخی دیده نشه
زمانی که یخ‌ها آب شدند، کرایوتیوب را به هود لامینار منتقل کرده و سریعا ۲ سی سی محیط کشت کامل را به مرور به کرایو اضافه کرده و خیلی آهسته پیپتاژ کنید و به فالکون سانتریفیوژ منتقل کنید که DMSO خنثی شده و سلولها کمترین آسیب ممکن را ببینند.
تصویری از ریختن سلولها به درون فالکون برای سانتریفیوژ
به مدت ۵ دقیقه در ۱۲۰۰ دور سانتریفیوژ کنید. محیط رویی که حاوی DMSO را دور ریخته و رسوب سلول را درون یک سی سی محیط کامل سوسپانسیون کنید و به فلاسک منتقل کرده و محیط کشت کامل را به آن اضافه کنید.
دقت کنید
- وقتی سلولها را به فلاسک منتقل کردید حتما فلاسک رو به شکل ۸ حرکت دهید تا سلولها همه جای فلاسک پخش کنید. اگر سلولها به خوبی پخش نشوند در یکجا تجمع کرده و نمیتوانند به خوبی رشد کننده در نتیجه نمیتوانند تقسیم شده و از فلاسک کنده می‌شوند.
- بهتر است سلولها را شمارش کنید مقدار سلول ها اگر کم باشد سلولها رشد نمیکنند. سلول‌هایی که درون فلاسک میریزید باید بتوانند با هم ارتباط برقرار کرده و سیگنال منتقل کنند. از طرفی نباید در یک ناحیه تجمع کنند در این صورت به دلیل کمبود جا جدا شده میمیرند.
- سعی کنید هر رو ز به سلولها سر بزنید و زیر میکروسکوپ ببینید که سلولها چسبیده باشند و تعداد سلولهای شناور (مرده) زیاد نباشد.
- هنگامی که محیط کشت به زردی رفت محیط قدیمی را دور ریخته و محیط کشت جدید به فلاسک اضافه کنید.
- برای مطالعه دقیق‌تر مراحل دفریز سلول میتوانید به زبان انگلیسی از سایت cellero مطالعه کنید.
