برای نگهداری طولانی مدت سلول هایی که باهاشون کار میکنید باید اونارو فریز کنید. وقتی با سلول ها کاری ندارید و یا لازم دارید از اونها یک پشتیبان (back up) تهیه کنید تا بدون پاساژ مداوم بعد باز هم بتونید اونها رو کشت بدید و استفاده کنید این کلیپ رو مشاهده کنید و توضیحات بیشتر رو در این مقاله بخونید.
در این مقاله از پویاژن آزما میخواهیم به آموزش نحوه فریز سلول برای نگهداری طولانی مدت بپردازیم .
https://www.aparat.com/v/LDPlx
بهترین زمان برای فریز سلول
بهترین زمان برای فریز سلول ها و گرفتن back up از آنها وقتی هست که اونها در حداکثر رشد خود قرار گرفتند یا یک فلاسک ها با تراکم بالا پر کردند.
وسایل موردنیاز فریز کردن سلول
برای فریز سلولها اول از همه باید طبق اصول کشت سلول که قبلا توضیح داده شد، هود لامینار و وسایلی مورد نیاز مانند سمپلر ( صدتا هزار و ده تا صد میکرولیتر)، سرسمپلر (آبی و زرد)، فالکون برای سانتریفیوژ و کرایوتیوب را استریل کنید. کرایوتیوب ها برای قرار گرفتن در دمای بسیار پایین مناسب هستند . وقتی آنها را در دمای ۱۷۰- (تانک ازت) قرار میدیم میتونن مقاوم باشند و به هیچ عنوان نمیشکنند.
تصویری از نوعی کرایوتیوب برای فریز سلولها
آماده سازی سلول ها
قبل از اینکه سلول ها رو آماده کنید اول روی کرایوتیوب ها اسم رده ی سلولی، تاریخ، تعداد پاساژ و اسم خودتون رو بنویسید. بعد از اون باید سلولها رو با بافر PBS شست و شو بدید و مانند پاساژ سلول ها تریپسینه کنید. بعد از سانتریفیوژ، اول سلول ها رو بشمارید چون مهمه که در هر کرایو چندتا سلول بریزید. اما این تعداد برای هر سلول متفاوته و شما باید پروفایل سلولتون رو سرچ کنید تا ببینید مناسب ترین تعداد برای فریز سلولهاتون چقدره که وقتی اونها رو دفریز میکنید بهترین بازده رو داشته باشه. اما بطور عمومی میتوان ۱۰۷ تا ۱۰۷ × ۵ سلول در میلی لیتر برای وقتی محیط کامل (با سرم) استفاده کنید و ۱۰۷ × ۰/۵ تا ۱۰۷ سلول در میلی لیتر برا وقتی سرم به تنهایی استفاده میشه، در هر کرایو فریز کرد.
آماده کردن کرایوتیوب ها
بعد از شمارش سلول ها تعیین کنید که چند کرایو میخواید بگیرید و بعد از دور ریختن سوپرناتانت (محیطی که بعد از سانتریفیوژ روی سلولها تشکیل میده) سلول ها رو در میزان مناسب از محیط کشت کامل یا سرم بدون محیط (ضرب ۹۰۰ میکرولیتر در تعداد کرایوتیوب)، سوسپانسیون کنید و در هر کرایو ۹۰۰ میکرولیتر تقسیم کنید. هربار که ۹۰۰ میکرولیتر میریزید، هم بزنید تا سلولها خوب سوسپانسیون باشند و ته نشین نشند. در نهایت میتونید ۱۰۰ میکرولیتر DMSO (Dimethyl sulfoxide) هم بریزید تا مانع از کریستاله شدن سلولها بشه.
تصویری از خلاصه مراحل فریز سلول
انتقال به فریزر
مواظب باشید که DMSO برای سلولها سمیه و باید بعد از ریختن اون روی سلولها سریع به فریزر منتقل کنید. یک روش به این صورته که اول به مدت ۲ ساعت در فریزر ۲۰- بذارید و بعد از اون به فریزر ۸۰- انتقال بدید و حتما بعد از ۲۴ ساعت تا حداکثر یک هفته داخل تانک ازت بذارید و یادتون نره که یادداشت کنید اونارو کجا میذارید تا بعد راحت پیداشون کنید.
تصویری از قرار دادن سلولهای فریز شده در یک رک داخل تانک ازت
بعد از خواندن این مطلب باید بتوانیم رده های سلولی مختلف رو برای نگهداری طولانی مدت فریز کنید.
منبع برای مطالعه بیشتر:
https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-protocols/freezing-cells.html
