پویاژن آزما

رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی منفی

رنگ آمیزی گرم و رنگ آمیزی منفی
فهرست مطالب

برای کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی میکروارگانیسم ها را به صورت زده و مرده (رنگ آمیزی شده) با استفاده از میکروسکوپ مشاهده کنیم. در مقالات قبل درباره مشاهده باکتری زیر میکروسکوپ توضیح داده شد.در این مقاله روش مشاهده میکروارگانیسم ها با رنگ آمیزی منفی و گرم آموزش داده شده است. همراه پویاژن آزما باشید…

برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.

09101438051 / 02140443676

پیشنهاد: خرید کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما که از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت. با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت.

رنگ آمیزی منفی (negative staining)

اصول رنگ آمیزی منفی

در این نوع رنگ آمیزی باید از رنگ های اسیدی مثل مرکب چین ( indian ink) یا نیگروزین استفاده کرد این رنگ ها دارای کروموژن با بار منفی هستند وبه این ترتیب قادر به نفوذ درون سلول نیستند چرا که بار الکتریکی سطح سلول های باکتری ها نیز منفی است. بنابر این، سلول های فاقد رنگ در زمینه ای رنگی قابل رویت خواهند بود از این رنگ آمیزی برای بررسی باکتری هایی که به سختی رنگ می گیرند و اسپور ها استفاده می شود. در این روش نیازی به فیکساسیون حرارتی نیست و سلول ها در معرض اثرات ناشی از مواد شیمیایی و حرارت ( همانند تغییر شکل سلول ) قرار نمی گیرند بنابراین اندازه و شکل سلول ها به صورت طبیعی مشاهده می شود.

مواد مورد استفاده رنگ آمیزی منفی

محیط کشت

کشت مخلوط باکتری های مورد نظر درلوله.

معرف

نیگروزین یا مرکب چین

لوازم مورد نیاز

  • شعله چراغ
  • لوپ تلقیح
  • سینی رنگ آمیزی
  • لام شیشه ای
  • میکروسکپ

پروتکل رنگ آمیزی منفی

  1. یک قطره نیگروزین را دریک انتهای لام قراردهید.
  2. یک لوپ پراز باکتریهای مورد نظر را در این قطره وارد کرده وبا فیلدوپلاتین،رنگ وباکتری را کاملاً مخلوط کنید(شکل a,b).
  3. به کمک یک لام دیگر، این مخلوط رنگ – باکتری، را در سطح لام بگسترانید در این حالت لام دوم را با یک زاویه 30 تا 45 درجه ای، از محل قطره تا محل نزدیک به انتهای دیگر لام بکشانید(شکل c,d ) .
  4. بگذارید گسترش در هوا خشک شود(شکلe) .(لام را توسط حرارت خشک نکنید).
  5. با میکروسکپ زمینه روشن و با عدسی 100 نمونه را بررسی کنید.
روش رنگ آمیزی منفی

روش تهیه گسترش نازک و رنگ آمیزی منفی

رنگ آمیزی منفی باسیلوس

رنگ آمیزی منفی باسیلوس

اهداف رنگ آمیزی باکتری ها

  1. اساس شیمیایی وتئوری با روشهای رنگ آمیزی تفرقی (diffrentiate staining)
  2. اساس شیمیایی رنگ گرم
  3. تمایز بین دو گروه از با کتری ها(گرم مثبت وگرم منفی)

اصول کلی رنگ آمیزی گرم

رنگ امیزی گرم مهمترین روش رنگ آمیزی در میکروبیولوژی است و به منظور شناسایی و تشخیص افتراقی باکتری های مختلف استفاده می شود. کریستین گرم، دانشمند دانمارکی این روش را ابداع کرد (1884). لازمه این نوع رنگ آمیزی افتراقی، استفاده از چهار نوع عامل یا معرف شیمیایی است که به ترتیب بعد از فیکساسیون توسط حرارت بکار برده می شوند. عمل اولین رنگ، رنگ آمیزی تمام سلول های باکتریایی می باشد. برای تثبیت بهتر رنگ دومین عامل که لوگل نام دارد و تر کیبی از ید و یدور پتاسیم است اضافه می شود.

سومین عامل یک معرف رنگبر است که از جنس الکل یا مخلوط الکل ـ استون می با شد. بر پایه ترکیب شیمیایی دیواره سلولی با کتری ها، عوامل رنگبر قادرند رنگ اولیه را بطورکامل از سلول زدوده و یا اینکه فقط از ساختمان خاص سلولی آن را تخلیه نمایند اگر رنگ اولیه از سلول تخلیه شود سلول بی رنگ شده، اجازه ورود به رنگ دوم را می دهد. آخرین معرف، رنگ زمینه است که رنگی متضاد با رنگ اولیه دارد به این تر تیب انواع سلول ها یا تر کیبات آن ها می توانند در این نوع رنگ آمیزی بر پایه رنگی که درون سلول باقی می ما ند از یکدیگر متمایز گردند.

رنگ اولیه در رنگ امیزی گرم

در رنگ آمیزی گرم، رنگ اولیه کریستال ویوله است که به رنگ بنفش می باشد. بنابراین در اولین مرحله تمام سلول ها (چه گرم مثبت وچه گرم منفی) این رنگ بنفش را به خود می گیرند، این رنگ جزء رنگهای بازی است و جذب سلول ها می شود.

سیر(تند ) کننده رنگ (mordant)

از محلول لوگل برای سیر کردن رنگ اولیه استفاده می شود ومحلولی است که با رنگ اولیه ترکیب شده، کمپلکس کریستال ویوله ـ ید(CV-I) تشکیل می دهند. تشکیل این کمپلکس سبب تشدید رنگ ا ولیه شده ودر نتیجه تمام سلول ها به رنگ بنفش تیره در می آیند. فقط در باکتریهای گرم مثبت ، (CV-I)به کمپلکس منیزیم ـ ریبونوکلوئیک اسید (mg-RNA) متصل شده و کمپلکس منیزیم ـ ریبونوکلوئیک اسیدـ کریستال ویوله ـ ید(CV-I-RNA-mg)تشکیل می شود که به مراتب مشکل تر از کمپلکس (CV-I) زدوده می شود.

معرف رنگبر در رنگ آمیزی گرم

اتانول 95% دو کار انجام می دهد

  1. حلال چربی است.
  2. عامل دهیدراته کنندگی پروتئین ها میباشد.

عملکرد عامل رنگبر به ضخامت لایه لیپیدی دیواره سلولی باکتری ها بستگی دارد .در باکتری های گرم مثبت ضخامت این لایه بسیار کم بوده و این عامل مهمی برای بقای کمپلکس (CV-I-RNA-mg) است. بنابراین، مقدار کم ترکیبات لیپیدی به سرعت توسط الکل حل شده باعث تشکیل منافذ ریزی در دیواره سلول می شود. بدنبال آن اثر آبگیری(هیدراتاسیون) الکل سبب مسدود شدن این منافذ می شود . در نتیجه پیوند محکم اولیه برداشته نشده ، وسلول به رنگ بنفش باقی می ماند.

در سلول های گرم منفی، لایه لیپیدی موجود در غشاء خارجی دیواره سلولی، تراکم زیادی دارد، بنابراین توسط الکل حل شده و منافذ متعددی را در دیواره سلول تشکیل می دهد که بطور محسوس با عمل دهیدراته شدن پروتئین های دیواره سلولی توسط الکل بسته نمی شود. این عمل باعث تسریع در تخلیه کمپلکس شده و در نتیجه این سلولها بی رنگ می شوند.

رنگ مخالف یا رنگ زمینه در رنگ آمیزی گرم

سافرانین ـ این عامل باعث رنگ کردن سلول هایی می شود که قبلاً توسط الکل رنگبری شده اند. از آنجا که سلول های گرم منفی دارای این خاصیت هستند ، در این مرحله سافرانین را جذب می کنند وقرمز می شوند . به جای سافرانین می توان از کربول فو شین استفاده کرد.

نکاتی مهم در زمینه تهیه و آماده سازی رنگ آمیزی گرم

  1. مرحله بحرانی این رنگ آمیزی ، مرحله رنگبری است. اگر این مرحله طولانی شود میکروبهای گرم مثبت رنگ خود را از دست داده وظاهرگرم منفی به خود می گیرند واگر این زمان خیلی کوتاه باشد کمپلکس ((CV-I بطور کامل خارج نشده ، باکتری گرم منفی بصورت گرم مثبت به نظر می اید.
  2. شستشوی لام با آب درمراحل مختلف رنگ آمیزی ضروری است . این عمل باعث زدودن رنگها و معرفهای مازاد از روی گسترش شده ولام را برای انجام مراحل بعدی آماده میکند.
  3. کشت باکتری باید جوان(24 ساعته) باشد . کهنه بودن کشت، خصوصاً درباکتری های گرم مثبت، سبب می شود که میکروارگانیسم ها توان نگهداری رنگ اولیه را از دست داده ، بصورت گرم متغیر(gram variable) دیده شوند. در این حالت تعدادی از سلول ها به رنگ بنفش وتعدادی دیگری به رنگ قرمز و اکثر باکتریها به رنگی بین بنفش و قرمز دیده می شوند.

مواد و روش رنگ آمیزی گرم

کشت ها

از کشت های 24 ساعته باکتری های مورد نظر استفاده می شود.

معرف ها

کریستال ویوله ـ لوگل ـ اتانل 95% وسافرانین.

لوازم مورد نیاز برای رنگ امیزی گرم

شعله چراغ ـ لوپ ـ سینی رنگ آمیزی ـ لامهای شیشه ای ـ کا غذ خشک کن ـ میکروسکپ.

مراحل رنگ آمیزی گرم باکتری

  1. تهیه گسترش از باکتری خالص و مخلوطی از باکتریهای مورد نظر
  2. خشکاندن در مجاورت هوا
  3. فیکساسیون با حرارت
  4. افزودن چند قطره کریستال ویوله (به مدت 30 ثانیه تا یک دقیقه دقیقه) روی گسترش (a).
  5. شستشوی گسترش درزیرجریان آرام آب(b).
  6. افزودن چند قطره لوگل روی گسترش(به مدت 1 دقیقه)(c) .
  7. شستشوی گسترش درزیرجریان آرام آب (d).
  8. افزودن چند قطره محلول الکل 95% روی گسترش تا زمانی که آخرین قطرات بنفش رنگ ازگسترش خارج شود (توجه : زمان رنگبری نباید طولانی شود. حدود 20-10 ثانیه )(e)
  9. شستشوی گسترش درزیرجریان آرام آب(f) .
  10. افزودن چند قطره سافرانین روی گسترش به مدت 30-20 ثانیه(g).
  11. شستشوی گسترش در زیرجریان آرام آب(h).
  12. خشک کردن گسترش با استفاده از کاغذ خشک کن.
  13. مشاهده میکروسکوپی (با بزرگنمایی های مختلف ولی در نهایت باید با عدسی×100 بررسی گردد).

توجه در این رنگ آمیزی، باکتریهای گرم مثبت به رنگ بنفش ، وبا کتریهای گرم منفی به رنگ قرمز دیده می شوند.

روش رنگ آمیزی گرمروش رنگ آمیزی گرم

مشاهدات و نتایج رنگ آمیزی گرم

  1. تصویر یک میدان دید میکروسکپ را نقاشی کنید.
  2. سلول ها را براساس شکل و ترتیب قرارگیری توضیح داده و تعریف کنید.
  3. رنگ سلول ها چگونه است؟
  4. ارگانیسمه ای موجود را بر اساس واکنش گرم تقسیم بندی کنید .(گرم مثبت یا گرم منفی)
نتیجه رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم از مخلوطی از استافیلوکوک اورئوس (کوکسی خوشه ای گرم مثبت بنفش) و اشریشیا کلی (میله ای گرم منفی صورتی)

اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.

09101438051 / 02140443676

امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و همچنین میتوانید درباره رنگ آمیزی اسیدفست مطالعه کنید.

برای کارآموزی مولکولی و میکروبی، خرید انواع کیت (پلاسمید، DNA، از ژل) و خدمات آزمایشگاهی با ما تماس بگیرید.

نویسندگان این محتوا در پویاژن آزما

دکتر مجید مقبلی
دکتری میکروبیولوژی از دانشگاه تهران
هیئت علمی دانشگاه
متخصص در زمینه مهندسی ژنتیک، تولید واکسن های نوترکیب و مخترع بیوفیلترهای صنعتی

فاطمه مقبلی
کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایران
تخصص در بخش درمان های نوین سرطان و مهندسی ژنتیک

سپیده ایمانی
کارشناس ارشد بیوتکنولوژی ملکولی از دانشگاه صنعتی مالک اشتر
تخصص در مهندسی ژنتیک، میکروبیولوژی غذایی و کنترل کیفیت

بهاره حسینی
کارشناس بیوتکنولوژی از دانشگاه خوارزمی
تخصص در بیوانفورماتیک و میکروب شناسی محیطی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

این سایت توسط reCAPTCHA و گوگل محافظت می‌شود حریم خصوصی و شرایط استفاده از خدمات اعمال.

The reCAPTCHA verification period has expired. Please reload the page.

منوی دسته های خود را در هدرساز -> موبایل -> منوی اصلی موبایل -> نمایش/مخفی -> انتخاب منو، تنظیم کنید.
اولین منوی خود را اینجا ایجاد کنید
سبد خرید
خانه
فروشگاه