برای کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی میکروارگانیسم ها را بصورت زده و مرده (رنگ آمیزی شده) با استفاده از میکروسکوپ مشاهده می کنیم.
در مقالات قبل درباره مشاهده باکتری ها بصورت زنده توضیح داده شد. همچنین میتوانید درباره انواع محیط کشت و نحوه جداسازی میکروارگانیسم ها از محیط های مختلف مطالعه کنید.
در این مقاله آزمایشگاه همکار پویاژن آزما تولید کننده انواع کیت استخراج DNA و محصولات بیوتکنولوژی، تلاش کرده تا روش مشاهده میکروارگانیسم های اسپوردار با رنگ آمیزی اسپور آموزش دهد.
شکل اسپور باکتری
برای آموزش های حضوری و کارآموزی میکروبیولوژی و کارآموزی مهندسی ژنتیک یعنی انجام دادن تمام تکنیک های میکروبی و مولکولی توسط خودتان میتوانید با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
محصول کیت استخراج DNA از باکتری تولیدی پویا ژن آزما از سخت ترین نمونه های باکتری مانند استافیلوکوکوس اورئوس با کیفیت بالا استخراج کرده و با به صرفه ترین قیمت و بیشترین کیفیت، نتایج PCR و تعیین سکانس عالی خواهید داشت.
عناوین مقاله رنگ آمیزی اسپور
اهداف مقاله رنگ آمیزی اسپور باکتری
- اساس شیمیایی رنگ آمیزی اسپور
- انجام روشی برای تمایز بین اسپور و اشکال رویشی باکتریایی
اصول کلی رنگ آمیزی اسپور
اسپور شکل مقاوم سلول رویشی در برخی باکتری هاست. از باکتری های بی هوازی جنس های کلستریدیوم و دسولفوتو ماکولوم، و از باکتری های هوازی جنس با سیلوسها از جمله میکروارگانیسم هایی هستند که دارای قدرت تشکیل اسپور هستند.
وقتی شرایط محیط برای رویش این سلول ها نامناسب شود (بعنوان مثال تمام شدن منبع کربن)، این سلول ها تشکیل اسپور می دهند.
از آنجایی که این اسپورها درون سلول تشکیل میشوند به آنها اندوسپور گفته میشود. اسپورتوسط لایه های نفوذ ناپذیری بنام
پوشش اسپور احاطه شده است. اگرشرایط نامساعد محیطی همچنان ادامه یابد و بدتر شود اندوسپورها از درون سلول رویشی آزاد شده و بصورت خارج سلولی (غیروابسته به سلول) درمی آیند که دراینصورت اسپور نامیده میشوند.
وجود ترکیبات شیمیایی در لایه های اسپور آن ها را نسبت به اثرات زیان بار حرارت بالا، انجماد، امواج رادیویی، و مواد شیمیایی همچون رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی مقاوم میکند . با فراهم شدن شرایط محیطی مناسب، اسپورها به صورت سلول رویشی فعال در می آیند.
رنگ آمیزی اسپور به دو روش انجام می شود:
- رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین (یا رنگ آمیزی شافر فولتون schaeffer-falton)
- رنگ آمیزی اسپور به روش روش هانسن
شماتیک از ساختار اسپور باکتری
روش مالاشیت گرین رنگ آمیزی اسپور باکتری
رنگ آمیزی مالاشیت گرین در سه مرحله انجام می شود.
1) رنگ اولیه : مالاشیت گرین
بدلیل وجود پوشش های غیر قابل نفوذ در اطراف اسپور، رنگ پذیری آن براحتی صورت نمی گیرد. برای نفوذ بهتر رنگ وجود حرارت الزامی است. بهمین دلیل بعد از ریختن مالاشیت گرین روی گسترش، عمل حرارت دادن انجام می گیرد. در پایان این مرحله، سلول رویشی و اسپور، هر دو سبز رنگ خواهند شد.
2) معرف رنگ بر
آب قادر به رنگ بری اسید نیست و نمی تواند رنگ را از اسپور خارج کند. از طرف دیگر مالاشیت گرین تمایل زیادی به تر کیبات سلول های رویشی نشان نمی دهد. بنابراین آب می تواند براحتی رنگ را از سلول رویشی خارج کند. در اینصورت سلول های رویشی بی رنگ شده و آماده پذیرش رنگ بعدی می شود.
3) رنگ متضاد : (سافرانین)
از این معرف برای رنگ پذیری سلول های رویشی استفاده می شود، بنابراین جذب سلول ها شده و آن ها را قرمز رنگ میکند حال آنکه اسپور برنگ سبز باقی مانده است.
مواد مورد نیاز برای رنگ آمیزی اسپور با روش مالاشیت گرین
کشت ها
ازکشت نوترینت آگار 48 تا 72 ساعته باکتری با سیلوس سرئوس (B. cereus ) و S. aureus و کشت تیوکلیکولات آکارباکتری کلستریدیوم استفاده می شود.
معرف ها
مالاشیت گرین (malachit green) و سافرانین (safranin )
وسایل
شعله، صفحه داغ (hot plate )، سینی رنگ آمیزی، لوپ تلقیح، لامهای شیشه ای، کاغذ خشک کن، کاغذعدسی و میکروسکپ
پروتکل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین
- تهیه گسترش ازباکتری اسپوردار و بدون اسپور بصورت مخلوط
- خشک کردن در مجاورت هوا
- فیکساسیون توسط حرارت
- افزودن مالاشیت گرین روی گسترش و حرارت دادن بمدت 5 دقیقه(a)
- سرد کردن گسترش وشستشوی آن با جریان ملایم آب(b)
- افزودن سافرانین روی گسترش بمدت30 ثانیه(c)
- شستشوی گسترش با جریان ملایم آب(d)
- خشک کردن باکاغذ خشک کن(e) ومشاهده با میکروسکپ به کمک عدسی x 100
دراین رنگ آمیزی اسپور برنگ سبز و جسم رویشی باکتری قرمز دیده می شود (شکل).
روش رنگ آمیزی اسپر با مالاشیت گرین
نمونه ای از اسپر مرکزی در باسیلوس رنگ شده با مالاشیت گرین
مشاهدات، نتایج و گزارش کار رنگ آمیزی اسپور با روش مالاشیت گرین
بعد ازمشاهده تمام لام ها بکمک عدسی x 100 ، نتایج خود را در ثبت کنید.
تصویری از یک میدان دید میکروسکپی هر نمونه را بکشید و جایگاه اندوسپور درون سلول رویشی را مشخص کنید که آیا مرکزی، نزدیک به انتها یا انتهایی (بترتیب central ، subterminal و terminal ) هستند همچنین رنگ اسپور و سلول رویشی را مشخص کنید.
رنگ آمیزی اسپور به روش هانسن
روش هانسن طی مراحل زیر انجام می گیرد.
بعد از تهیه گسترش، خشک شدن در هوا و فیکساسیون توسط حرارت، مراحل زیر صورت می گیرد.
- افزودن رنگ کربول فوشین روی گسترش وحرارت دادن آن بمدت 15-10 دقیقه.
- سرد کردن گسترش وشستشوی آن با جریان ملایم آب.
- رنگبری با محلول اسید استیک 5% بنحوی که لام صورتی رنگ شود.
- شستشوی گسترش با جریان ملایم آب.
- افزودن متیلن بلو برروی گسترش بمدت 3 دقیقه.
- شستشوی گسترش با جریان ملایم آب.
- خشک کردن گسترش ، مشاهده با میکروسکپ ( x 100)در این حالت اسپور برنگ قرمز و سلول رویشی، آبی رنگ دیده می شود (شکل).
رنگ آمیزی اسپر در باسیلوس با روش هانسن
اگر مایلید تست های میکروبی و مهندسی ژنتیک را آموزش ببینید و خودتان انجام دهید، به صفحه کارآموزی مهندسی ژنتیک و کارآموزی میکروبیولوژی سر بزنید یا با ما تماس بگیرید.
09101438051 / 02140443676
پیشنهاد ژن آزما: خرید کیت استخراج DNA از انواع نمونه و محصولات مولکولی از فروشگاه تخصصی پویاژن آزما
امیدواریم این مقاله برای شما مفید بوده و انواع کشت باکتری را یاد گرفته باشید. اگر به میکروبیولوژی صنعتی علاقمندید
میتوانید درباره نحوه انتخاب سویه های باکتری برای صنعت نیز مطالعه کنید.
همچنین این شرکت دانش بنیان تولید کننده انواع سیستم تصفیه آب صنعتی بر پایه بیوفیلتر میباشد.
