در مهندسی ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، مهمترین تکنیک مورد استفاده در آزمایشگاه تکنیک PCR (Polymerase chain reaction) است. تکنیک PCR برای تکثیر یک قطعه ژنی خاص در مدت زمان کوتاه به میلیون‌ها کپی می‌باشد.
۵ مرحله اصلی که برای تکنیک PCR باید انجام شوند
- طراحی و سنتز پرایمر
- استخراج ژنوم
- الکتروفورز ژنوم استخراجی
- PCR
- الکتروفورز محصول PCR
طراحی و سنتز پرایمر
فرض کنید شما یک ژن اختصاصی دارید که نیاز دارید تعداد زیادی از این توالی سنتز شده را داشته باشید. برای اینکار باید دو توالی کوتاه (برای ابتدا و انتهای ژن) که مکمل توالی ژن مورد نظر شما باشد تا آنزیم پلیمراز انتهای آزاد آن را شناخته و بتواند از ادامه ی پرایمر ژن شما را سنتز کند. البته برای طراحی پرایمر قوانینی وجود دارد که در بخش جداگانه بطور کامل به آن پرداخته ایم. همچنین شرکت پویاژن آزما در این زمینه مشاوره و خدمات طراحی و سنتز پرایمر را برای شما انجام می دهد.
تصویر شماتیک از یک جفت پرایمر متصل شده به ابتدا و انتهای یک ژن
استخراج ژنوم
شما برای تکثیر یک توالی خاص ابتدا باید کل ژنوم مورد نظر را استخراج کنید. برای اینکار میتوانید از کیت های استخراج DNA پویاژن آزما استفاده کنید تا با کمترین هزینه و بازدهی کاملا مناسب برای انجام PCR بهینه سازی شده است. این کیت ها برای نمونه های باکتری(انواع باکتری گرم مثبت و منفی)، خون، بافت، سلول، قارچ و مخمر بصورت جداگانه طراحی شده تا شما به سادگی و در کوتاه ترین زمان بتوانید استخراج DNA را انجام دهید.
تصویر انواع کیت استخراج DNA تولیدی پویاژن آزما
الکتروفورز
پس از استخراج ژنوم می توانید برای اطمینان از انجام درست این استخراج آن را روی ژل آگارز ران کنید تا باندهای DNA را مشاهده کنید. همچنین درنهایت حتما محصول بدست آمده از PCR را روی ژل آگارز در کنار یک مارکر مناسب ران کنید تا با توجه به کیفیت و اندازه باند ایجاد شده متوجه شوید که PCR به درستی انجام شده است. می توانید در این مقاله به تفصیل راجع به الکتروفورز بخوانید
تصویری از ران کردن نمونه داخل ژل آگارز درون تانک الکتروفورز
آنزیم مورد استفاده در تکنیک PCR
در PCR برای تکثیر ژن از آنزیم DNA پلیمراز استفاده میشود. در ابتدا از آنزیم معمولی استفاده شد اما به دلیل افزایش دما در واکنش ها این آنزیم ها از بین میروند و روند کار مشکل می شد. برای حل این مشکل از آنزیم استخراج شده از باکتری های ترموفیل استفاده شد که در دمای بالا مقاوم بوده و از بین نمی روند.
این دمای بالا برای جداسازی دو رشته ی DNA از یکدیگر لازم است تا در مراحل بعدی پرایمرها به جایگاه اختصاصی خود متصل شده و سپس آنزیم بتواند از ادامه ی پرایمر سنتز کند. در این مقاله می توانید انواع آنزیم های DNA پلیمراز تکنیک PCR را فرا بگیرید.
عملکرد آنزیم DNA پلیمراز در مرحله طویل سازی از PCR
تاریخچه ای کوتاه از تکنیک PCR
این تکنیک اولین بار توسط کری مولیس در سال ۱۹۸۵ معرفی شد که برنده جایزه نوبل نیز گشت. از سال ۱۹۷۱ دانشمندان روی روش های مشابه تحقیق میکردند که گروهی از دانشمندان نروژی یک واکنش آنزیمی را برای تکثیر یک توالی DNA کوتاه توضیح دادند که مانند PCR با استفاده از توالی پرایمر استفاده میشد.
کری مولیس، کسی که جایزه نوبل را به دلیل معرفی PCR گرفت
در سال ۱۹۸۸ اولین ماشین PCR توسط خورانا معرفی شد. از آن زمان تغییرات زیادی بر این دستگاه اعمال شده و دستگاه های بهتر و بهبود یافته ای را ایجاد کردند.
کمک بزرگ تکنیک PCR
این تکنیک کاربردهای گسترده ای دارد. برای مثال کمک بزرگی در پروژه توالی یابی ژنوم انسان بوده و بدون کمک PCR این توالی یابی به این سرعت ممکن نبود و بسیار کند پیش میرفت.
در مقاله های جداگانه میتوانید تاریخچه PCR، مراحل انجام تکنیک PCR و انواع PCR را بخوانید.
